核酸提取及常见问题分析教学内容

10-40 μg
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒
全血
100 μl－1ml
动物细胞培养液
106－107cells
动物组织
30mg
病毒基因组提取试剂盒 DNA RNA
酵母基因组DNA提取试剂盒 Lyticase(20U/ μg）
3-30 μg 5-30μg 10-30μg
不同材料对SDS提取试剂盒提取量
阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸 高盐低pH值洗脱
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磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从 而达到分离目的
硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒
超薄
CB1 5μg 100bp40kp
普通
CB2 20μg 100bp40kp
大量
CB3 40μg 100bp40kp
寡核苷酸
CB2 20μg 20bp10kb
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬 溶液II裂解 溶液III中和
抽提 上层溶液
酒精沉淀
离心洗涤
质粒DNA溶液
干燥溶解
离心柱型 质粒DNA提取试剂盒
96血液基因组DNA试剂盒
一次实验可提取96个样品，快捷、方便。
基因组DNA－其它裂解方法
根据细胞裂解方式的不同有：
– 物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融 – 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解 – 生物方式：酶法
基因组DNA纯化的方法
吸附材料结合法：
吸附材料
纯化原理
硅质材料
高盐低pH值结合核酸 低盐高pH值洗脱
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
100 mM 20 mM 1.4M
CTAB PVP40 β-巯基乙醇
3%(W/V)
5%(W/V)
2%（V/V） 使用前加入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
20 mM
NaCl 1.4M
SDS
2%(W /V)
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；
SDS法流程图
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
100 mM
20 mM 1.4M
CTAB β-巯基乙醇
RNA、蛋白质、多糖等
DNA提取的方法
基因组DNA的提取
CTAB法 SDS法
质粒DNA的提取
碱裂解法 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA提取主要方法
CTAB法
适用于植物组织，真菌等
SDS法
适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等
CTAB法(植物DNA提取经典法)
裂解液
动物组织细胞 组织匀浆 细胞裂解
抽提 上层溶液
酒精沉淀 离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
SDS提取试剂盒
细菌基因组DNA提取试剂盒 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 病毒基因组提取试剂盒 酵母基因组DNA提取试剂盒
CB2：20 (μg)
不同材料对SDS提取试剂盒提取量
细菌基因组DNA提取试剂盒 1－5ml细菌菌液/离心柱
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
CTAB法流程图
植物材料 液氮研磨 细胞裂解
裂解液 抽提
上层溶液
酒精沉淀 离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
植物基因组DNA提取试剂盒
每个离心柱处理 材料的量为 鲜重：100mg 干重：30mg
缓冲液GP1 缓冲液GP2 去蛋白液GD 洗脱缓冲液TE 吸附柱CB2(20μg) 收集管
小提 小提中 量
1－5ml 5-15ml
CB3
CB4
大提 高纯度 高纯度小 无内毒 酵母 小提 提中量 素小提
96
CB2 20μg 100bp40kp
质粒DNA提取
TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.
碱裂解法 煮沸法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
SDS法
原理
➢ SDS 阴离子去垢剂
高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析
➢ 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴）
使蛋白质及多糖杂质沉淀
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提
乙醇沉淀水相中的DNA
SDS提取缓冲液的配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
100mM
EDTA （pH8.0）
核酸提取及常见问题分析
核酸提取及常见问题分析
DNA提取 及常见问题分析
TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.
DNA提取及常见问题分析 DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析
DNA提取的原则
保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染