核酸提取及常见问题分析教学内容
核酸提取技术CDC培训
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
q 原理
质粒DNA－碱裂解法
在pH 12.0～12.6环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并在高盐浓度的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在 去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、 RNA与蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
• 阴离子交
换树脂
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷 高效。
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用 于纯度要求高的实验。
基因组DNA－其它方法 ➢ 浓盐法：
➢ 有机溶剂抽提法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 密度梯度离心法：
影响RNA提取的因素
标 本、 细菌培养物
基因组DNA－SDS法 裂解抽提
上层溶液
离心洗涤 干燥溶解
酒精沉淀 DNA溶液
基因组DNA－其它方法 q 根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法 q 根据核酸分离纯化方式的不同有：
材料准备 基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
Ø 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不 要反复冻融
Ø 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞 （白细胞）
Ø 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成 DNA降解
核酸检测专题知识讲座
破碎裂解细胞
分离单个核细胞 Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺） 密度梯度离心法，因为血液中各有形 成份旳比重存在差别，所以得以分离。 红细胞和粒细胞密度不小于分层液，同 时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当旳单个核细胞密集在血浆层和分层液旳界面中，呈白膜状，吸收该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞取得率可达80％以上，其高下与室温有关，超出25℃时会影响细胞取得率。
（一）基因组DNA提取
取组织块 3剪碎，加TE缓冲液0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 将匀浆液转移到1.5 ml离心管中。 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K(2 mg/ml)25 μl，混匀。 60 ℃ 水浴1-3 h。
蛋白酶K使多种蛋白质水解，而且蛋白酶K可在SDS存在下有活性。
a 匀浆法
（三）RNA提取及鉴定
材料准备
TRIZOL可裂解细胞，促使核蛋白体旳解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性旳苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这么RNA与仍留在有机相中旳蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
分离质粒旳三大环节
材料准备
使用处于对数期旳新鲜菌体（老化菌体造成开环质粒增长） 培养时应加入筛选压力，不然菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝旳质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
质粒DNA提取
（二）非基因组DNA提取
b 液氮研磨法
培养细胞处理：
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法检验科人员是核酸检测工作的主力军，我们不但要保证检测结果的有效性，还时刻面临着被感染的风险。
本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。
1、传染源目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。
无症状感染者也可能成为传染源。
2、传播途径经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径。
在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。
由于在粪便及尿中可分离到新型冠状病毒，应注意粪便及尿对环境污染造成气溶胶或接触传播。
3、荧光PCR原理重复进行“变性 - 退火 - 延伸”三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。
4、常见问题解析①新冠试剂出现翘尾，怎么处理？答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。
如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。
设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
③新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。
高中化学核酸的教案设计
高中化学核酸的教案设计随着科技的不断发展，生物化学领域的研究日益深入，其中核酸作为生命活动的重要物质基础，更是受到了广泛关注。
在高中化学教学中，核酸的教学同样占据了重要的地位。
今天，我们就来分享一份高中化学核酸的教案设计范本，帮助大家更好地理解和掌握这一知识点。
一、教学目标1. 知识与技能：理解核酸的基本概念、结构和功能，掌握核酸的化学组成和性质。
2. 过程与方法：通过实验操作，培养学生观察、分析和解决问题的能力，提高学生的实践操作能力。
3. 情感态度与价值观：激发学生对生物化学的兴趣，培养学生探索科学的精神。
二、教学内容1. 核酸的基本概念、结构和功能。
2. 核酸的化学组成和性质。
3. 核酸在生命活动中的作用。
三、教学方法1. 采用讲授法，讲解核酸的基本概念、结构和功能，以及核酸的化学组成和性质。
2. 采用实验法，让学生亲自动手进行核酸提取实验，观察和分析实验现象，加深对核酸性质的理解。
3. 采用讨论法，引导学生探讨核酸在生命活动中的作用，培养学生的思考和表达能力。
四、教学过程1. 引入：通过讲述生物体内的遗传信息传递过程，引出核酸的概念和重要性。
2. 讲解：详细讲解核酸的基本概念、结构和功能，以及核酸的化学组成和性质。
3. 实验：指导学生进行核酸提取实验，观察和分析实验现象，加深对核酸性质的理解。
4. 讨论：组织学生讨论核酸在生命活动中的作用，引导学生思考和表达自己的观点。
5. 总结：对本节课的内容进行总结，强调核酸的重要性和作用。
五、教学评价1. 过程评价：观察学生在实验过程中的操作和表现，了解学生对实验方法和步骤的掌握情况。
2. 结果评价：通过课堂提问、小组讨论等方式，了解学生对核酸基本概念、结构和功能的理解程度。
3. 综合评价：结合学生的学习表现、实验结果和讨论内容，对学生的核酸知识掌握情况进行综合评价。
六、教学反思1. 优点：本节课采用了多种教学方法，既有讲授又有实验和讨论，使学生在多方面得到了锻炼和提高。
DNA提取及常见问题解决方案
二、基因组DNA-SDS法
（1）原理
SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温(55 -65℃） 条件下能裂解细胞．细胞中DNA与蛋白质之间常借 静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏 这种价键,所以常用阴离子去污剂使染色体离析，蛋 白质变性，释放出核酸。
提高盐(KAc或NH4Ac）浓度并降低温度(冰 浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去 沉淀。
策
烈，DNA被机械打断
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
一、基因组DNA-CTAB法
（1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexademide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种 阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形 成复合物。
该复合物在高盐溶液（ Nacl ＞0.7mol/L ）是 可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多 糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。
DNA提取原则
1、应保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染 3、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
一、标本的要求和保存
血液 EDTA做抗凝剂，不可用肝素
RNA DNA
尽快提取或者-20℃保存 4℃短期保存
组织
新鲜组织
液氮罐保存（-80℃）
石蜡玻片和包埋组织 应没有H.E染色
室温保存
上清液用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质，再用
核酸检测课程设计思路和方法
核酸检测课程设计思路和方法一、课程目标知识目标：1. 学生能够理解核酸检测的基本概念，掌握核酸检测的原理和步骤。
2. 学生能够了解新冠病毒核酸检测的重要性，认识到核酸检测在疫情防控中的作用。
3. 学生能够掌握核酸检测结果判定标准，并能够解读核酸检测报告。
技能目标：1. 学生能够运用所学知识，正确进行核酸检测实验操作，包括样本采集、核酸提取和扩增等步骤。
2. 学生能够运用批判性思维，分析核酸检测过程中可能出现的误差和问题，并提出解决方案。
3. 学生能够运用信息素养，收集和整理与核酸检测相关的资料，进行数据分析和解读。
情感态度价值观目标：1. 学生通过学习核酸检测，培养对生物科学研究的兴趣，增强探索精神和科学态度。
2. 学生能够认识到核酸检测在疫情防控中的重要性，形成关爱生命、尊重科学的价值观。
3. 学生在合作完成核酸检测实验过程中，培养团队协作能力和沟通能力，增强集体荣誉感。
课程性质：本课程为生物学科拓展课程，结合新冠病毒核酸检测实际，以提高学生的生物科学素养和实践能力为主。
学生特点：学生为八年级学生，具备一定的生物科学基础，好奇心强，善于合作和探究。
教学要求：教师应注重理论与实践相结合，引导学生主动参与实验操作，培养其科学思维和实际操作能力。
同时，关注学生情感态度价值观的培养，使其在学习过程中形成正确的价值观。
通过分解课程目标为具体学习成果，为后续教学设计和评估提供依据。
二、教学内容1. 核酸检测基本原理：介绍核酸检测的概念、原理，以及DNA和RNA的区别与联系。
相关教材章节：生物课本中关于基因和遗传信息的章节。
2. 核酸提取与扩增技术：讲解核酸提取的方法、PCR技术原理及其在核酸检测中的应用。
相关教材章节：生物技术相关章节，特别是PCR技术的介绍。
3. 核酸检测实验操作：详细讲解样本采集、核酸提取、扩增和检测等实验步骤，强调操作注意事项。
相关教材章节：实验操作方法及生物实验室安全相关章节。
4. 核酸检测结果判定：介绍核酸检测结果的判定标准，解读核酸检测报告。
4.3核酸教学设计2023-2024学年高二下学期化学人教版(2019)选择性必修3
讲授法：通过案例分析，帮助学生深入理解核酸的功能。
实践活动法：组织讨论，让学生在实践中应用所学知识。
合作学习法：通过小组合作，培养团队协作能力。
- 作用与目的：
加深对核酸知识点的理解，通过实践活动，提高解决问题的能力。
3. 课后拓展应用
- 教师活动：
布置作业：根据课堂内容，布置相关作业，巩固学习成果。、离心提取法等。
- 分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
5. 核酸检测技术
- PCR技术：聚合酶链式反应，用于快速扩增特定的DNA片段。
- 基因芯片：高通量检测基因表达或基因型。
6. 核酸在生物技术中的应用
- 基因工程：通过DNA重组技术，改变生物体的遗传特性。
反思总结法：引导学生进行自我反思，促进学习进步。
- 作用与目的：
巩固课堂所学，拓宽知识视野，通过反思提升自我学习能力。
知识点梳理
1. 核酸的基本概念
- 定义：核酸是生物体内携带遗传信息的物质，由核苷酸组成。
- 分类：DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。
- 核苷酸组成：含氮碱基、五碳糖（脱氧核糖或核糖）、磷酸。
例题4：请列举至少两种核酸提取方法及其原理。
答案：
1. 酚-氯仿提取法：利用酚和氯仿的溶解度差异，将核酸与蛋白质、脂质等杂质分离。
原理：酚能溶解细胞膜，破坏细胞结构；氯仿能沉淀蛋白质等杂质。
2. 离心提取法：通过高速离心，将细胞碎片、蛋白质等沉淀，使核酸在上清液中得以提取。
原理：利用核酸和细胞碎片、蛋白质等在离心力作用下的沉降速度差异。
4.3核酸 教学设计 2023-2024学年高二下学期化学人教版（2019）选择性必修3
核酸_提取实验报告
一、实验目的1. 学习核酸提取的基本原理和操作方法；2. 掌握动物组织细胞中核酸的提取和鉴定方法；3. 熟悉实验操作技巧，提高实验操作能力。
二、实验原理核酸是一类生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），它们在生物体的遗传、代谢和调控等过程中发挥着重要作用。
本实验通过提取动物组织细胞中的核酸，对其进行鉴定，以了解核酸的基本性质和功能。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠；2. 实验试剂：盐酸胍、氯化钠、柠檬酸钠、乙醇、异丙醇、二苯胺、3，5-二羟甲苯等；3. 实验仪器：离心机、匀浆器、电炉、水浴锅、显微镜等。
四、实验步骤1. 实验动物处死，取肝组织；2. 将肝组织剪碎，加入适量匀浆液，用匀浆器进行匀浆；3. 将匀浆液加入盐酸胍，使pH值降至6.0；4. 加入适量的氯化钠和柠檬酸钠，使溶液的离子强度达到0.14mol/L；5. 将溶液转移至离心管中，在4℃、5000g条件下离心10分钟；6. 取上清液，加入等体积的异丙醇，混匀；7. 将混合液转移至另一离心管中，在4℃、10000g条件下离心10分钟；8. 弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，在4℃、10000g条件下离心5分钟；9. 弃上清液，将沉淀干燥；10. 将干燥的沉淀溶解于适量的水中，加入二苯胺试剂，观察颜色变化；11. 加入3，5-二羟甲苯试剂，观察颜色变化；12. 根据颜色变化，判断核酸的类型。
五、实验结果1. 在二苯胺试剂的作用下，溶液呈蓝色，表明提取的核酸中含有DNA；2. 在3，5-二羟甲苯试剂的作用下，溶液呈绿色，表明提取的核酸中含有RNA。
六、实验分析1. 实验结果表明，通过本实验方法可以成功提取动物组织细胞中的核酸，并进行鉴定；2. 实验过程中，注意控制实验条件，如pH值、离子强度等，以保证核酸的提取效果；3. 实验结果与理论相符，验证了核酸提取方法的可行性。
七、实验总结1. 本实验成功提取了动物组织细胞中的核酸，并对其进行了鉴定；2. 通过实验，掌握了核酸提取的基本原理和操作方法，提高了实验操作能力；3. 本实验为后续研究核酸的功能和应用奠定了基础。
核酸提取和注意事项
核酸提取和注意事项核酸提取是一种常用的实验方法，用于从生物样品中提取核酸（DNA或RNA）。
核酸提取的目的是分离并纯化核酸，以便进行进一步的研究，如测序、PCR、酶切等。
然而，核酸提取是一项复杂且容易受到各种因素影响的实验步骤，因此需要特别注意一些事项，以确保提取到高质量的核酸。
其次，核酸提取需要在无菌、洁净的环境中进行。
核酸容易受到外源性DNA的污染，会影响提取到的核酸的纯度和酶活。
因此，在进行核酸提取前，必须保证实验台面和实验器皿的清洁，并特别注意避免手部和呼吸道的DNA污染。
另外，使用一次性消耗品或经过严格消毒的实验仪器也是必要的。
第三，选择合适的核酸提取方法和试剂盒。
目前，有多种核酸提取方法可供选择，如酚/氯仿法、基质柱法、磁珠法等。
不同的样品类型和研究目的，可能需要选择不同的提取方法。
同时，合适的试剂盒也会直接影响着核酸提取的效果和纯度。
因此，在选择方法和试剂盒时，要充分考虑实验需要、实验条件和提取效率等因素。
第四，正确的操作流程和实验技巧也是核酸提取的关键。
核酸提取过程中，应严格按照操作步骤进行，避免出现错误或漏操作。
特别需要注意的是，禁止使用锐利的工具或剪刀等进行样品切割，避免受到损伤导致核酸的降解。
此外，在悬浮细胞和组织细胞的裂解过程中，需要避免过度裂解或裂解时间过长，以避免释放大量的酶和细胞碎片影响核酸提取的效果。
最后，实验前后的设备检查和清洁也很重要。
在实验前，检查电动机、搅拌器和温度控制系统等设备是否正常工作，并校正相关的仪器和设备，确保实验的准确性和稳定性。
在实验结束后，及时清洁实验台面和仪器设备，避免DNA污染的交叉感染和混杂，保证下次实验的准确性。
综上所述，核酸提取是一项复杂的实验步骤，需要注意多个方面的细节。
在样品选择、无菌环境、方法和试剂盒选择、操作流程和技巧等方面都需要特别重视，以提取到高质量的核酸，并保证实验的准确性和稳定性。
这些小细节的注意，会对核酸提取的结果产生重大影响。
核酸的提取实验报告
一、实验目的1. 熟悉核酸提取的基本原理和实验操作步骤。
2. 掌握从动物组织中提取核酸的方法。
3. 了解核酸提取过程中需要注意的问题。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
本实验采用动物组织作为材料，通过破碎细胞膜和核膜，提取其中的核酸。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：动物肝脏、生理盐水、无水乙醇、氯仿、异丙醇、氯化钠、EDTA、Tris-HCl缓冲液、DNA酶、RNA酶等。
2. 实验仪器：研钵、研杵、移液枪、离心机、电热炉、紫外分光光度计、恒温水浴锅、玻璃棒等。
四、实验步骤1. 取新鲜动物肝脏，用生理盐水清洗，去尽血液，切成小块。
2. 将肝脏块放入研钵中，加入适量EDTA和Tris-HCl缓冲液，用研杵充分研磨，制成匀浆。
3. 将匀浆转移到离心管中，加入氯仿，剧烈振荡，使蛋白质和脂质与核酸分离。
4. 4℃、12,000 rpm离心15分钟，取上清液。
5. 将上清液加入等体积的异丙醇，静置2小时，使DNA沉淀。
6. 4℃、12,000 rpm离心10分钟，弃去上清液，用75%乙醇洗涤DNA沉淀。
7. 将DNA沉淀干燥，用适量Tris-HCl缓冲液溶解。
8. 通过紫外分光光度计测定DNA浓度。
9. 重复步骤2-8，提取RNA。
五、实验结果与分析1. 通过紫外分光光度计测定，DNA浓度为2.0 μg/μl，RNA浓度为1.5 μg/μl。
2. 从实验结果可以看出，DNA和RNA的提取成功，且提取效率较高。
六、实验讨论1. 在实验过程中，选择合适的动物组织是保证实验成功的关键。
本实验选用动物肝脏作为材料，因为肝脏中DNA和RNA含量较高，易于提取。
2. 在提取过程中，要尽量减少蛋白质和脂质的干扰。
本实验通过加入氯仿和异丙醇，使蛋白质和脂质与核酸分离。
3. 在实验过程中，要注意温度、pH值和离心速度等条件，以保证核酸的稳定性和提取效率。
核酸检测课程设计
核酸检测课程设计一、课程目标知识目标：1. 学生理解核酸检测的基本原理，掌握核酸检测在新冠病毒检测中的应用。
2. 学生了解核酸检测的实验步骤，掌握相关生物技术名词及操作方法。
3. 学生了解核酸检测结果判定标准，能分析检测结果与疫情控制的关系。
技能目标：1. 学生能独立完成核酸检测实验操作，提高实验技能。
2. 学生能运用所学知识解释核酸检测在疫情防控中的作用，提高分析问题解决问题的能力。
3. 学生通过小组合作，提高沟通协调能力和团队合作精神。
情感态度价值观目标：1. 学生树立正确的科学观念，认识到核酸检测在疫情防控中的重要性。
2. 学生培养严谨的实验态度，注重实验操作的规范性和准确性。
3. 学生关注社会热点问题，增强社会责任感和使命感，积极参与疫情防控工作。
课程性质：本课程为生物学科拓展课程，结合当前新冠病毒疫情防控背景，以提高学生的生物实验技能和科学素养为主。
学生特点：六年级学生具备一定的生物知识基础，对新鲜事物充满好奇心，具备初步的实验操作能力。
教学要求：注重理论与实践相结合，提高学生的实验操作能力和科学思维，培养学生关注社会、服务社会的价值观。
通过分解课程目标，为后续教学设计和评估提供明确依据。
二、教学内容1. 核心知识：- 核酸检测原理：DNA/RNA结构，聚合酶链反应（PCR）技术。
- 核酸提取与纯化：实验步骤，所需材料及仪器。
- 引物设计与合成：引物作用，设计原则。
- PCR扩增：扩增过程，循环参数设定。
- 结果分析：检测结果的判定，与新冠病毒感染的关系。
2. 实践操作：- 核酸提取：动手操作，熟悉实验流程。
- PCR实验：模拟PCR扩增过程，了解实验操作要点。
- 结果观察：观察实验结果，学会分析判断。
3. 教学安排与进度：- 第一课时：介绍核酸检测原理，学习DNA/RNA结构和PCR技术。
- 第二课时：学习核酸提取与纯化，进行实践操作。
- 第三课时：学习引物设计与合成，了解PCR扩增过程。
1生物的核酸提取及常见的问题
DNase的抑制剂 DNase的抑制剂
加入少量金属离子螯合剂， 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L Na或柠檬酸钠 DNase基本可以全部 或柠檬酸钠， EDTA2 Na或柠檬酸钠，DNase基本可以全部 失活。 失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase DNase失活。 DNase失活。 失活
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； Na2EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制 螯合Mg 离子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； 提供一个高盐环境， 充分溶解，存在于液相中； 充分溶解 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜 β- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，
线粒体和叶绿体：生物体内的半自主性细 线粒体和叶绿体： 胞器，自身可编码蛋白。 胞器，自身可编码蛋白。它们的比重和大 小一定，同一离心场内有确定的沉降速度。 小一定，同一离心场内有确定的沉降速度。 故可采用密度梯度离心的方法分离， 故可采用密度梯度离心的方法分离，使用 均匀介质（蔗糖、氯化铯等）。 均匀介质（蔗糖、氯化铯等）。
溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出， 注：CTAB溶液在低于 ℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物 溶液在低于 材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 ℃ 材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB抽提缓冲液的经典配方 CTAB抽提缓冲液的经典配方
核酸提取及常见问题分析——王伟
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。
原因
1. 材料丌新鲜、反复冶
1. 尽量取新鲜材料，低温保
融或细胞衰老冶融或 细胞衰老 2. 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 3. 外源核酸酶污染
对 策
存避免反复冶融 2. 可增加裂解液中螯合剂的 含量 3. 细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔 4. 所有试剂用无菌水配制， 耗材经高温灭菌 5. DNA分装保存于缓冲液 ，避免反复冶融
测定结果分析
测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／ OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小 分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的 情冴。
当沉淀时间有限时，用预况的乙醇或异丙醇 沉淀，沉淀会更充分 。
沉淀后应用70％乙醇洗涤，以除去盐离子等
晾干DNA，让乙醇充分挥发（丌要过分干燥）
样本保存和前处理
• 抗凝血液
• 非抗凝血 • 微量血液/干血点 • 口拭子/漱口水
样本保存和前处理－抗凝血液
• 保存: 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶 反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,使用柠檬 酸或EDTA处理血样。 加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月； －70℃长期保存。 尽可能保证样本丌经过反复冶融！ • 样本前处理: 1. 冶存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。 2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。
核酸提取及常见问题分析
A-6：聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶不同，其采用 胶浸泡液回收凝胶内DNA，而非溶胶液，胶块本身 就不会溶解。 Q-7：电泳检测只有一条目的带，可否选用凝胶回 收试剂盒？ A-7：可以，如果后续实验对片段纯度要求较高， 建议即使只有一条用，也可以切胶纯化，其回收得 到片段的纯度可能要比值接回收高一些。 Q-8：琼脂糖凝胶胶块不溶？ A-8：1．琼脂糖质量不好．２．含目的片段的凝胶 再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶 后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20 ℃ 。 3．制胶的电泳缓冲液浓度高或陈旧。
北京博大泰克公司，所有的公司中的产品中最便宜， 效果还不错，试剂盒中的各种成分可单独购买
北京TIANGEN公司（又名天根生化），原名北京天为时代， 2005年与德国QIAGEN建立合作，挂名其子公司，所以改 名TIANGEN公司，技术上借鉴了QIAGEN，产品性能与其 接近，而价格便宜得多。 其他公司：国外：美国promega, invitrogen, clontech，加拿大BBI等 国内：长沙安比奥生物，江苏碧云天，上海生工， 上海申能博彩等 可以酌情选用。
利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到 目的片段？ A-5：可能有以下几个原因： 1．胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增 加上下颠倒次数辅助溶解； 2．胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回 收； 3．电泳缓冲液PH太高，硅基质膜在高盐低PH结 合DNA，如PH太高， 应作适当调整； 4．漂洗液中未加入无水乙醇。 Q-6：为什么聚丙烯酰胺凝胶加入d Mega Kit(质粒可转细 菌,酵母) QIAfilter PlasmidmMega Kit(质粒可转细 胞) （2）100bp 以下的片段胶回收: MinElute Gel extration kit 可回收70 bp4kb的片段; QIAGEX II gel extraction kit,可回收40 bp-50kb的片段
《专题八 第二节 核酸》教学设计教学反思
《核酸》教学设计方案（第一课时）一、教学目标1. 知识目标：学生能够理解核酸的基本观点，掌握核酸的种类和结构。
2. 能力目标：学生能够通过实验观察核酸的分子结构，培养实验操作技能。
3. 情感目标：通过学习核酸，增强学生对生命科学的兴趣和探索精神。
二、教学重难点1. 教学重点：核酸的基本观点和种类。
2. 教学难点：核酸的分子结构及其在生物体内的作用。
三、教学准备1. 准备教学用具：核酸结构模型、多媒体教学设备、相关PPT课件。
2. 准备实验材料：核酸提取试剂、荧光染料、显微镜等。
3. 预习相关内容：学生提前预习核酸相关知识，为教室讨论做准备。
4. 安排实验室参观：在课前安排学生参观实验室，了解核酸实验操作流程。
四、教学过程：（一）导入新课1. 展示核酸图片，请学生识别图片中的物质。
2. 引出核酸的观点，并强调其在生物体内的作用。
3. 引导学生思考：核酸是如何影响生物的发展发育、遗传变异和蛋白质的生物合成的？（二）新课教学1. 核酸的分类和结构基础（1）核酸的分类：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。
（2）核酸的结构基础：磷酸、戊糖（DNA中的为脱氧核糖，RNA中的为核糖）、碱基。
（3）引导学生观察DNA和RNA的结构模型，总结其异同点。
2. DNA的结构和功能（1）DNA双螺旋结构模型：引导学生观察DNA双螺旋结构模型，并讲解DNA双螺旋结构的基本特点。
（2）碱基配对原则：A-T、G-C。
强调这对配对原则是DNA 结构稳定的重要因素。
（3）DNA的结构和功能干系：讲解DNA的主要功能——遗传物质。
强调DNA是生物体遗传信息的主要载体，其结构决定生物体的遗传特性。
3. RNA的结构和功能（1）引导学生了解RNA的种类和功能。
（2）mRNA——蛋白质合成：讲解基因的转录过程，并强调这一过程是遗传信息从DNA传递到RNA的过程。
（3）tRNA——氨基酸的转运和毗连：讲解转运氨基酸的机制以及如何将氨基酸毗连形成蛋白质。
核酸提取及常见问题分析
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
核酸提取及常见问题分析
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
策
3. DNA中残留有金属离 子
1. 重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前）
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
核酸提取及常见问题分析
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
核酸提取及常见问题分析
基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
做核酸教案反思
做核酸教案反思
教案标题：做核酸教案反思
教学目标：
1. 了解核酸的基本知识和重要性。
2. 掌握核酸提取和检测的基本方法和步骤。
3. 培养学生的实验操作能力和科学思维能力。
教学内容：
1. 核酸的基本概念和结构特点。
2. 核酸提取的原理和方法。
3. 核酸检测的原理和常用技术。
教学步骤：
1. 导入：通过图片、视频等形式引入核酸的概念，激发学生的学习兴趣。
2. 理论讲解：介绍核酸的基本知识，包括DNA和RNA的结构、功能等内容。
3. 实验操作：组织学生进行核酸提取和检测实验，让他们亲自动手操作，加深
对核酸实验的理解。
4. 总结反思：让学生总结实验过程中的经验和教训，思考实验结果的意义和可
能的应用。
教学方法：
1. 多媒体教学：运用图片、视频等多媒体资源生动形象地介绍核酸的相关知识。
2. 实验操作：通过实验操作让学生亲身体验核酸提取和检测的过程，加深理解。
3. 讨论交流：组织学生进行小组讨论和交流，促进学生之间的思想碰撞和知识
分享。
教学评价：
1. 实验报告：要求学生对实验过程和结果进行详细的记录和分析，撰写实验报告。
2. 口头答辩：组织学生进行口头答辩，展示实验成果，并对实验过程中的问题进行讨论和解答。
教学反思：
1. 教学目标是否明确，教学内容是否贴合学生的实际需求？
2. 教学方法是否多样化，能否激发学生的学习兴趣和积极性？
3. 教学评价是否全面客观，能否准确反映学生的实际水平和能力？
通过对教学过程的反思，不断完善教学内容和方法，提高教学质量，促进学生的全面发展。
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96
CB2 20μg 100bp40kp
质粒DNA提取
TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.
碱裂解法 煮沸法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸 高盐低pH值洗脱
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从 而达到分离目的
硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒
超薄
CB1 5μg 100bp40kp
普通
CB2 20μg 100bp40kp
大量
CB3 40μg 100bp40kp
寡核苷酸
CB2 20μg 20bp10kb
96血液基因组DNA试剂盒
一次实验可提取96个样品，快捷、方便。
基因组DNA－其它裂解方法
根据细胞裂解方式的不同有：
– 物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融 – 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解 – 生物方式：酶法
基因组DNA纯化的方法
吸附材料结合法：
吸附材料
纯化原理
硅质材料
高盐低pH值结合核酸 低盐高pH值洗脱
原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
小提 小提中 量
1－5ml 5-15ml
CB3
CB4
大提 高纯度 高纯度小 无内毒 酵母 小提 提中量 素小提
裂解液
动物组织细胞 组织匀浆 细胞裂解
抽提 上层溶液
酒精沉淀 离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
SDS提取试剂盒
细菌基因组DNA提取试剂盒 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 病毒基因组提取试剂盒 酵母基因组DNA提取试剂盒
CB2：20 (μg)
不同材料对SDS提取试剂盒提取量
细菌基因组DNA提取试剂盒 1－5ml细菌菌液/离心柱
10-40 μg
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒
全血
100 μl－1ml
动物细胞培养液
106－107cells
动物组织
30mg
病毒基因组提取试剂盒 DNA RNA
酵母基因组DNA提取试剂盒 Lyticase(20U/ μg）
3-30 μg 5-30μg 10-30μg
不同材料对SDS提取试剂盒提取量
20 mM
NaCl 1.4M
SDS
2%(W /V)
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；
SDS法流程图
SDS法
原理
➢ SDS 阴离子去垢剂
高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析
➢ 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴）
使蛋白质及多糖杂质沉淀
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提
乙醇沉淀水相中的DNA
SDS提取缓冲液的配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
100mM
EDTA （pH8.0）来自因组DNA－ CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
100 mM 20 mM 1.4M
CTAB PVP40 β-巯基乙醇
3%(W/V)
5%(W/V)
2%（V/V） 使用前加入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
核酸提取及常见问题分析
核酸提取及常见问题分析
DNA提取 及常见问题分析
TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.
DNA提取及常见问题分析 DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析
DNA提取的原则
保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染
RNA、蛋白质、多糖等
DNA提取的方法
基因组DNA的提取
CTAB法 SDS法
质粒DNA的提取
碱裂解法 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA提取主要方法
CTAB法
适用于植物组织，真菌等
SDS法
适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等
CTAB法(植物DNA提取经典法)
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
100 mM
20 mM 1.4M
CTAB β-巯基乙醇
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬 溶液II裂解 溶液III中和
抽提 上层溶液
酒精沉淀
离心洗涤
质粒DNA溶液
干燥溶解
离心柱型 质粒DNA提取试剂盒
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
CTAB法流程图
植物材料 液氮研磨 细胞裂解
裂解液 抽提
上层溶液
酒精沉淀 离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
植物基因组DNA提取试剂盒
每个离心柱处理 材料的量为 鲜重：100mg 干重：30mg
缓冲液GP1 缓冲液GP2 去蛋白液GD 洗脱缓冲液TE 吸附柱CB2(20μg) 收集管