第五章生物技术在抗生素中的应用
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突变克隆技术是指利用整和质粒或噬菌体将原株DNA转 入到抗生素产生菌中，由于基因有同源性，有可能发生基因重 组，一旦某DNA片段的插入干扰了原株某个生物合成基因的转 录，即得到了这个生物合成基因的阻断变株，其相应的DNA片 断就是这个阶段的生物合成基因。
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
泰乐菌素(tylosin)生物合成的最后一步是大菌素 (macrMin)在0—甲基转移酶催化下转化为泰乐菌素； SenoE．T．等发现高产的弗氏链霉菌中O—甲基转移酶 比活性也高，但与泰乐星产量不成比例，并积累有较多的 大菌素，故推测大菌素甲基化这一步反应可能是限速阶段；
第五章 现代生物技术在抗生素工业中应用
抗生素产业是生物医药产业的重要组成部分，在全球医 药市场6500亿美元的总规模中，抗生素占到6%-8%左右， 近年来世界抗生素市场的年均增长率约为8％。
我国整体抗感染药市场规模巨大，药品份额保持在25％30％左右，我国销售排名前50位药物中，抗生素占据14席， 前10位中，抗生素占据5席。
基因的特点
（3）抗生素生物合成基因除定位在染色体上 外，还发现有的定位在质粒上。
次甲霉素A生物合成基因就定位在天蓝色链 霉菌的SCP1质粒上。
二、克隆抗生素生物合成基因的方法
①阻断变株法； ②突变克隆法： ③直接克隆法； ④克隆抗生素抗性基因法 ⑤寡核甘酸探针法； ⑥同源基因杂文法； ⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法。
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
④克隆抗生素抗性基因法
抗生素生物合成基因和抗性基因是连锁的
一般抗性基因只有1—2kb，较易检测和克隆。
利用段。
⑤寡核苷酸探针法
链霉菌基因对密码子的利用有明显的不随机性，即DNA 中G十C的比例为70％以上，密码子第三位有90％以上常为G或C。
⑥同源基因杂交法
利用一种已克隆的抗生素生物合成基因片段 为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆 抗生素生物合成基因。
由于基因保守序列的同源性，利用同源基因 杂交法克隆化学结构类似的抗生素生物合成基因是比 较快速准确的方法。
⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法
如果有单酶基因表达产物的检测方法，可以 利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌的DNA克隆到最常 用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主菌中的个 别基因产物，筛选克隆子从而分离到相应的基因。
菌种筛选
菌种改良
生物技术
改进工艺
• 第一节 基因工程的应用
• 第二节 细胞工程和 酶工程应用
• 第三节 抗生素耐药性 与新药筛选技术
第一节 基因工程的应用
利用基因重组技术，提高现有菌种的生产能力和改 造现有菌种使其产生新的代谢产物。
目前克隆的抗生素合成基因已经有23种之多。通过 DNA重组技术，在适宜的宿主菌中将特定的抗生素基因 进行重组，产生了6种新 “杂合”抗生素。
GTGTCCAC
TGTTTTTGG
③直接克隆法
由于抗生素生物合成基因往往成簇存在，使得有可能克隆 整套生物合成基因。主要用于基因簇相对较小(＜30kb)的抗生 素生物合成基因。
但筛选阳性转化子的工作量比较大， 较大的生物合成基 因簇片段在宿主菌中不够稳定。
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
因此，有些抗生素生物合成酶被分离纯化后，就可能 获得这些酶的部分氨基酸序列。根据氨基酸序列推导设计出较 低程度简并性的基因序列，序列推测可能的DNA序列
ß-内酰胺类抗生素生物合成途径中的第一个有生物 活性的中间体是异青霉素N是由pcbC基因编码的异青霉素N合成 酶（IPNS）酶促形成的。这种基因是采用“反向遗传学”方法 克隆到的。
利用这一特性，成功地预测了链霉菌的酪氨酸酶 基因以及红霉素链霉菌的红霉素抗性基因的转录方向。
基因的特点
（2）根据对不同化学类别的抗生素生物合成 基因的定位研究，发现参与每种抗生素生物合成的基 因约为l0一30个，几乎总是成簇存在的，如次甲霉素、 新霉素、红霉素、紫霉素、卡那霉素、土霉素、链霉 素、嘌罗霉素、氯霉素的生物合成基因都在一个基因 簇中。
牛津大学的Abraham和同事首先纯化了IPNS ．礼莱公 司的研究者则获得其N末端氨基酸序列。根据已知的氨基酸序 列，以合成的寡核苷酸为探针，通过杂交来识别含有相关DNA 序列的克隆体、经DNA序列分析发现一个可读框．并能在大肠 杆菌中表达，这种重组大肠杆菌可产生IPNs，故证实已克隆到 了Pcbc基因。
①阻断变株法
通过—系列阻断变株的互补结果来确定被克 隆DNA片段的性质。
首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株， 从野生型菌株中分离DNA，与载体连接后转入阻断变 株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同 阶段的酶基因。
放线紫红素(actinorhodin)是天蓝色链霉菌 产生的酸碱条件下由红变蓝的指示剂抗生素。根据色 素差异和合成反应，将76株突变体按表型分为Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组，每组代表不同生物合成步骤 发生的损伤。
对一些抗生素的生物合成基因和抗性基因的结构、 功能、表达和调控有了较深入的了解，利用重组微生物来 提高已知代谢物的产量和发现新产物已引起高度重视。
一、抗生素生物合成基因的特点
（1）链霉菌抗生素生物合成基因结构的典型特征 之—，是高G—C碱基组成，(G—C)的百分含量达70% 以上。三联体密码子中的第3个碱基的G、C比例极高
用低拷贝质粒pIJ 922的BamHI位点从act+菌 株中克隆了一个25kb的片段，并转化阻断突变株，能 互补除act V以外的所有突变体。
在此基础上又组建了pIJ2303质粒，它能互 补所有7类突变体。所以，质粒pIJ2303上的外源DNA 片段携带了放线紫红素生物合成的全部信息。
②突变克隆法
三、提高抗生素量的方法
利用基因工程技术有目的地定向改造基因、提高基 因的表达水平以改造菌种的生产能力
1．增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数
抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成 中的限速阶段，识别位于合成途径中的“限速瓶颈”，并 没法导入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，如果增加的 中间产物不对合成途径中某步骤产生反馈抑制，就有可能 增加最终抗生素的产量。
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泰乐菌素(tylosin)生物合成的最后一步是大菌素 (macrMin)在0—甲基转移酶催化下转化为泰乐菌素； SenoE．T．等发现高产的弗氏链霉菌中O—甲基转移酶 比活性也高，但与泰乐星产量不成比例，并积累有较多的 大菌素，故推测大菌素甲基化这一步反应可能是限速阶段；
第五章 现代生物技术在抗生素工业中应用
抗生素产业是生物医药产业的重要组成部分，在全球医 药市场6500亿美元的总规模中，抗生素占到6%-8%左右， 近年来世界抗生素市场的年均增长率约为8％。
我国整体抗感染药市场规模巨大，药品份额保持在25％30％左右，我国销售排名前50位药物中，抗生素占据14席， 前10位中，抗生素占据5席。
基因的特点
（3）抗生素生物合成基因除定位在染色体上 外，还发现有的定位在质粒上。
次甲霉素A生物合成基因就定位在天蓝色链 霉菌的SCP1质粒上。
二、克隆抗生素生物合成基因的方法
①阻断变株法； ②突变克隆法： ③直接克隆法； ④克隆抗生素抗性基因法 ⑤寡核甘酸探针法； ⑥同源基因杂文法； ⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法。
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
④克隆抗生素抗性基因法
抗生素生物合成基因和抗性基因是连锁的
一般抗性基因只有1—2kb，较易检测和克隆。
利用段。
⑤寡核苷酸探针法
链霉菌基因对密码子的利用有明显的不随机性，即DNA 中G十C的比例为70％以上，密码子第三位有90％以上常为G或C。
⑥同源基因杂交法
利用一种已克隆的抗生素生物合成基因片段 为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆 抗生素生物合成基因。
由于基因保守序列的同源性，利用同源基因 杂交法克隆化学结构类似的抗生素生物合成基因是比 较快速准确的方法。
⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法
如果有单酶基因表达产物的检测方法，可以 利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌的DNA克隆到最常 用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主菌中的个 别基因产物，筛选克隆子从而分离到相应的基因。
菌种筛选
菌种改良
生物技术
改进工艺
• 第一节 基因工程的应用
• 第二节 细胞工程和 酶工程应用
• 第三节 抗生素耐药性 与新药筛选技术
第一节 基因工程的应用
利用基因重组技术，提高现有菌种的生产能力和改 造现有菌种使其产生新的代谢产物。
目前克隆的抗生素合成基因已经有23种之多。通过 DNA重组技术，在适宜的宿主菌中将特定的抗生素基因 进行重组，产生了6种新 “杂合”抗生素。
GTGTCCAC
TGTTTTTGG
③直接克隆法
由于抗生素生物合成基因往往成簇存在，使得有可能克隆 整套生物合成基因。主要用于基因簇相对较小(＜30kb)的抗生 素生物合成基因。
但筛选阳性转化子的工作量比较大， 较大的生物合成基 因簇片段在宿主菌中不够稳定。
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
因此，有些抗生素生物合成酶被分离纯化后，就可能 获得这些酶的部分氨基酸序列。根据氨基酸序列推导设计出较 低程度简并性的基因序列，序列推测可能的DNA序列
ß-内酰胺类抗生素生物合成途径中的第一个有生物 活性的中间体是异青霉素N是由pcbC基因编码的异青霉素N合成 酶（IPNS）酶促形成的。这种基因是采用“反向遗传学”方法 克隆到的。
利用这一特性，成功地预测了链霉菌的酪氨酸酶 基因以及红霉素链霉菌的红霉素抗性基因的转录方向。
基因的特点
（2）根据对不同化学类别的抗生素生物合成 基因的定位研究，发现参与每种抗生素生物合成的基 因约为l0一30个，几乎总是成簇存在的，如次甲霉素、 新霉素、红霉素、紫霉素、卡那霉素、土霉素、链霉 素、嘌罗霉素、氯霉素的生物合成基因都在一个基因 簇中。
牛津大学的Abraham和同事首先纯化了IPNS ．礼莱公 司的研究者则获得其N末端氨基酸序列。根据已知的氨基酸序 列，以合成的寡核苷酸为探针，通过杂交来识别含有相关DNA 序列的克隆体、经DNA序列分析发现一个可读框．并能在大肠 杆菌中表达，这种重组大肠杆菌可产生IPNs，故证实已克隆到 了Pcbc基因。
①阻断变株法
通过—系列阻断变株的互补结果来确定被克 隆DNA片段的性质。
首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株， 从野生型菌株中分离DNA，与载体连接后转入阻断变 株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同 阶段的酶基因。
放线紫红素(actinorhodin)是天蓝色链霉菌 产生的酸碱条件下由红变蓝的指示剂抗生素。根据色 素差异和合成反应，将76株突变体按表型分为Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组，每组代表不同生物合成步骤 发生的损伤。
对一些抗生素的生物合成基因和抗性基因的结构、 功能、表达和调控有了较深入的了解，利用重组微生物来 提高已知代谢物的产量和发现新产物已引起高度重视。
一、抗生素生物合成基因的特点
（1）链霉菌抗生素生物合成基因结构的典型特征 之—，是高G—C碱基组成，(G—C)的百分含量达70% 以上。三联体密码子中的第3个碱基的G、C比例极高
用低拷贝质粒pIJ 922的BamHI位点从act+菌 株中克隆了一个25kb的片段，并转化阻断突变株，能 互补除act V以外的所有突变体。
在此基础上又组建了pIJ2303质粒，它能互 补所有7类突变体。所以，质粒pIJ2303上的外源DNA 片段携带了放线紫红素生物合成的全部信息。
②突变克隆法
三、提高抗生素量的方法
利用基因工程技术有目的地定向改造基因、提高基 因的表达水平以改造菌种的生产能力
1．增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数
抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成 中的限速阶段，识别位于合成途径中的“限速瓶颈”，并 没法导入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，如果增加的 中间产物不对合成途径中某步骤产生反馈抑制，就有可能 增加最终抗生素的产量。