微生物实验技术应用实例优秀课件

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《微生物纯培养技术》课件

纯培养技术可用于病原微生物的分离、鉴定和药物敏感性试验，为临床诊断和治疗提供依据。
微生物纯培养技术
02
的基本原理
微生物的分离与纯化
微生物的分离
通过选择合适的培养基和培养条件，将混合的微生物群体分离成单一的微生物个体。
微生物的纯化
通过反复划线、稀释接种等方法，获得纯培养的微生物，即同一菌种或纯种微生物的培养。
微生物的培养基
培养基的组成
培养基是由水、碳源、氮源、无机盐等组成，根据不同微生物的需求，培养基的成分和比例会有所不同。
培养基的制备
根据配方和操作步骤，将各种成分混合在一起，经过灭菌处理后，制成适合微生物生长的培养基。
微生物的培养条件
温度
不同微生物对温度的需求不同，适宜的温度可以促进微生物的生长和代谢。
生理生化特性分析
测定微生物的生理生化特性，如氧化酶试验、糖发酵试验等。
应用前景探讨
探讨微生物纯培养技术在生产、科研等领域的应用前景和潜在价值。
微生物纯培养技术04Fra bibliotek的应用实例
在医学领域的应用
抗生素生产
01
微生物纯培养技术用于分离和培养具有抗生素产生能力的菌株
，为医学领域提供大量抗生素。
疾病诊断
《微生物纯培养技术》 ppt课件
目录
• 微生物纯培养技术概述 • 微生物纯培养技术的基本原理 • 微生物纯培养技术的实验操作 • 微生物纯培养技术的应用实例 • 微生物纯培养技术的挑战与展望
微生物纯培养技术
01
概述
微生物纯培养技术的定义
01
微生物纯培养技术是指通过一定的物理、化学手段，将自然界中混杂的微生物群体分离出来，获得纯种微生物的技术。

微生物的培养与应用 ppt课件

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。
微生物的培养与应用
系列稀释操作
101
102
103
1mL水的试管灭菌并编号。 (2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。
微生物的培养与应用
涂布平板操作讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
微生物的培养与应用
三、结果分析与评价
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一、微生物的实验室培养
（一）培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质称培养基培养基的基本成分
一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水等（具体见教材15页“100mL牛肉蛋白胨培养基的营养构成”）。
微生物的培养与应用
1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？
碳源是葡萄糖，氮源是尿素。 2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
微生物的培养与应用
（二）统计菌落数目
原理
运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高
时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的

《微生物实验》课件

实验三微生物的纯种分离法思考题在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。稀释分离时，为什么要将融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入装有菌液的培养皿内？划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？培养时为什么要将培养皿倒置培养？
实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验器材
实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、放线菌及霉菌。
菌种：
马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏一号固体培养基
培养基：
无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作台及恒温培养箱。
其他：
斜面接种
实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验方法
实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验方法液体接种斜面液体培养基接种环将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。
中心实验室提供
微生物学实验教学课件
汇报人姓名
目录
实验一培养基的配置、分装和灭菌实验二环境中微生物的检测和菌落识别实验三微生物的纯种分离实验四细菌染色法和光学显微镜的使用实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验七微生物显微镜直接计数法实验八细菌芽孢染色法实验九微生物生长量的测定和生长曲线的绘制实验十物理、化学因素对微生物生长的影响实验十一细菌鉴定中的生理生化反应实验十二食用菌菌种的分离和制种技术实验十三环境中细菌分离鉴定综合实验
实验一培养基的配ຫໍສະໝຸດ 、分装与灭菌实验方法实验一培养基的配置、分装与灭菌实验方法

微生物技术及应用PPT课件-2024鲜版

生长曲线的调控与优化讲解如何通过改变培养条件或使用特定的生长因子等手段，调控和优化微生物的生长曲线，以满足实验或生产需求。
10
03
微生物代谢与发酵技术
2024/3/28
11
微生物的代谢途径与调控
糖代谢途径
包括糖酵解、三羧酸循环等，产生ATP和还原
力。
2024/3/28
氮代谢途径
包括氨基酸、核苷酸和蛋白质的代谢，合成细
2024/3/28
33
微生物在医药工业中的应用
生产抗生素
利用微生物发酵技术生产抗生素，如青霉素、链霉素等，用于治疗各种细菌感染。
生产疫苗
利用微生物培养技术生产疫苗，如麻疹疫苗、流感疫苗等，用于预防传染病。
生产酶制剂
利用微生物发酵技术生产酶制剂，如淀粉酶、蛋白酶等，用于促进药物合成和分解。
2024/3/28
研究微生物生长、底物消耗和产物生成的动力学关系。
发酵设备与技术
包括发酵罐设计、传质与传热、在线监测与控制等。
2024/3/28
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发酵产品的分离与纯化
预处理
去除发酵液中的菌体、杂质等，提高后续分离纯化效率。
2024/3/28
分离方法
包括萃取、吸附、膜分离等，根据目标产物的性质选择合适的分离方法。
医学领域
利用微生物技术生产疫苗和诊断试剂，预防和治疗各种传染病和慢性病。此外，基因工程和细胞工程等技术在医学领域也有广泛应用。
2024/3/28
农业领域
利用微生物肥料和生物农药等技术，提高农作物产量和品质，减少化学肥料和农药的使用。
环境领域
利用微生物处理污水和废气等环境污染物，以及进行环境监测和评价等工作。

微生物的培养和利用PPT课件

氧元素—— 物质本身不含水。
滴有浓硫酸的滤纸炭化变黑。
C.强氧化性
（１）金属与浓硫酸反应：浓硫酸可以与除 Au、Pt外的金属加热反应，一般不产生H2，而是产生硫的化合物SO2；
思考：
１.反应前后溶液及铜丝有那些变化？
铜与浓硫酸反应
２.实验发生后品红溶液有何变化？
３.盛品红溶液试管口的棉花起什么作用？
H2S + H2SO4（浓）= S↓ + SO2 + 2H2O
疑问：
(a)H2S、NH3能用浓硫酸干燥吗？为什么呢？ (b)能用浓硫酸干燥的气体有哪些呢？
CO2、Cl2、H2、O2、NO2、SO２、HCl等
4.在5NH4NnO3=2HNO3+4N2 +9H2O的反应中,被氧化的氮原子与被还原的氮原子
（２）Ｃ、Ｓ、Ｐ非金属等与浓硫酸反应: 浓硫酸的还原产物一般为SO2
C + 2H2SO4（浓）= CO２↑+ 2SO2↑+ 2H2O
S + 2H2SO4（浓）= 3SO2↑+ 2H2O
（３）还原性化合物与浓硫酸反应:
2NaI + 2H2SO4（浓）= Na2SO4 + I2 + 2SO2 ↑+2H2O
（1）都含有氢元素。
（2）H2SO4 = 2H＋+ SO42－酸的通性实
HCl = H＋+Cl－
质就是H＋的
HNO3 = H＋+NO3－性质。
• 酸的通性：
稀硫酸 H2SO4 = SO42-+2H+
石蕊试液
金属 Fe
金属氧化物 CuO
碱
Cu(OH)2

微生物操作范例.ppt

2.平板划线接种：
（三）棉塞的制作
制作棉塞原则上采用普通棉花（非脱脂棉）
(四）玻璃仪器的包扎
1.移液管的包扎
2.试管的包扎
（五）获得菌种的途径：
1.从专业机构、科研机构、高等院校等获取
*广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼
电话：(020)37656629,35973334 *有微生物教学任务的高等院校
2.通过菌种分离
(1) 从自来水中分离大肠杆菌
我国城市自来水卫生标准，大肠杆菌指数<10个／升
(2)用简易组织分离法获得食用菌菌种
三、微生物实验技术操作规范示例
（一）斜面接种无菌操作技术（二）倒平板及平板划线接种（三）棉塞的制作（四）玻璃斜面接种无菌操作技术
(二）倒平板及平板划线接种
1.倒平板：按无菌要求，在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固化培养基（约50℃），倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，不超过培养皿高度的1/3。

《微生物采油》课件

实验步骤与实验结果
注入微生物，开始采油过程。
监测采油过程中的各项参数，如采收率、油品质量等。
实验步骤与实验结果
实验结果
油品质量得到改善，轻质油比例增加。
采收率显著提高，达到预期目标。
微生物对石油的降解作用明显，证实了其有效性。
实验结论与实验意义
01
实验结论
02 微生物采油技术具有可行性和优势，可提高采收率和油品质量。
微生物采油的未来展望
未来，微生物采油技术将更加注重与其他油田开发技术的结合，形成多学科交叉的油田开发
技术体系。
未来，微生物采油技术有望在非常规油田、老油田和边际油田的开发中发挥重要作用。
随着全球能源需求的不断增长，微生物采油技术有望成为未来重要的油田开发技术之一。
微生物采油技术将更加注重智能化和自动化技术的应用，提高采油效率和降低人工成本。
微生物采油的挑战与机遇
微生物采油技术面临的挑战主要包括提高采收率、降低成本、环保和安全生产等方面。
随着技术的不断进步和研究的深入，微生物采油技术将不断克服这些挑战，迎来更多的发展机遇。
政府和相关机构应加大对微生物采油技术的支持力度，推动其产业化进程，为油田开发提供更多选择和解决方案。
05
结论
微生物在地层中生长、繁殖和代谢，产生生物表面活性剂、溶剂和酸等代谢产物。
通过微生物及其代谢产物的物理和化学作用，降低原油粘度，提高采收率。
微生物采油的关键技术
微生物种类的选择与优化
针对不同油藏条件，选择适合的微生物种类并进行优化，提高采收率。
注入参数的确定
根据油藏条件和采收率要求，确定合理的注入参数，如注入量、注入速度
01

生物技术实践专题一微生物 PPT课件

选择培养基
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞
各种培养基的具体配方不同，但一般都包括哪些成分？

不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质。
注：另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。
倒平板: 待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.
倒平板:
注意:
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
掌握程度参考本考试大纲中的：一、考试的能力要求 2、实验与探究能力
一培养基:
（1）按培养基的（2）按培养基的化学成分分：物理形态分：液体培养基 · 天然培养基半固体培养基 · 合成培养基 · 半合成培养基固体培养基（3）按培养基的功能分：基础培养基选择培养基鉴别培养基
划线后
培养一段时间后
微生物的恒温培养
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

微生物技术应用-益生菌剂PPT课件

微生物技术应用——单细胞蛋白
二、芽孢杆菌制剂
（一）益生芽孢杆菌种类常见的有：蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地
衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、芽孢乳杆菌等。
国内市场上有：促菌生（蜡样芽孢杆菌）、整肠生（地衣芽孢杆菌）、益菌生（枯草芽孢杆菌）、乳康生（含蜡样芽孢杆菌）等。
微生物技术应用——单细胞蛋白
一、检测益生菌的经典方法
➢平板计数法（厌氧箱、厌氧罐、干燥器、半固体深层琼脂柱） ➢显微镜直接计数法 ➢代谢产物测定法
微生物技术应用——单细胞蛋白
二、益生菌的分子检测技术
➢16S rRNA寡核苷酸序列分析技术 ➢核酸杂交技术 ➢变性梯度凝焦电泳技术
➢目前用作饲料添加剂的微生物种类少，菌株性能单一，缺乏针对性； ➢加强对益生菌剂剂型的研究，减少加工对菌体的伤害，提高活菌浓度； ➢建立简单快速的益生菌剂监测系统，规范益生菌剂的生产和市场。
微生物技术应用——单细胞蛋白
第四节益生菌的检测方法
一、检测益生菌的经典方法二、益生菌的分子检测技术三、用于乳酸菌分离和培养的常见培养基
自益生菌剂的概念被提出后，它就成为了微生态的带名词。益生菌剂通常是指一类分离自机体内的正常微生物菌群，以高含量活菌为主体，通过定植作用改善宿主特定的部位的微生态平衡并兼有其它有益生理活性的生物制剂。
微生物技术应用——单细胞蛋白
二、益生菌剂与微生态制剂
构成益生菌剂的微生物种类很多，研究和使用最多的是用于调节肠道菌群平衡的乳酸杆菌和双歧杆菌制剂。饲用益生菌剂作为饲料中促进生长的抗生素替代品，有对动物无毒副作用，无耐药性，无残留，效果显著等特点逐渐得到广大养殖业者的首肯。

《微生物实验》课件2

03
04
数据整理
将实验过程中收集的数据进行分类整理，确保数据的准确性
和完整性。
数据可视化
利用图表、图像等形式将数据呈现出来，便于观察和分析。
数据对比
将实验数据与理论值或预期值进行对比，找出差异和规律。
数据检验
运用统计学方法对数据进行检验，以确定数据的可靠性和有
效性。
结果解读
结果解读原则
根据实验目的和要求，结合理论知识，对实验结果进行深入分析和解读。
结果验证
通过重复实验或对比实验，验证实验结果的可靠性和稳定性。
结果分析
分析实验结果与理论值或预期值的差异，探究可能的原因和影响因素。
结果应用
将实验结果应用于实际问题中，为解决实际问题提供科学依据和指导。
实验结论
结论总结
对实验过程和结果进行总结，提炼出关键信息和重点内容。
结论分析
对实验结论进行深入分析和探讨，探究其科学性和实用性。
结论应用
将实验结论应用于实际生产和科学研究中，发挥其指导作用和应用价值。
结论展望
对实验结论进行展望和预测，提出进一步研究的方向和思路。
05
微生物实验注意事项与安全防护
实验安全注意事项
实验前应充分了解实验原理、操作步骤及注意事项，确保实验过
程的安全性。
实验过程中要严格遵守操作规程，避免交叉污染和意外事故的发
无菌操作技术
灭菌
通过加热、紫外线、化学药剂等方法杀死物体表面或内部的微生物。
过滤除菌
利用过滤膜去除液体或气体中的微生物。
隔离技术
在无菌室内进行实验操作，避免微生物污染。
清洁与消毒
定期清洁实验器具和环境，使用消毒剂杀死微

微生物的培养技术及应用ppt课件

二、无菌技术获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，主要包括消毒和灭菌。
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，
还有什么作用？
还能有效避免操作者被微生物感染。
二、无菌技术 1.消毒（1）概念
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（2）消毒方法
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污接种结束后染环境和感染操作者
接种环共需灼烧几次？
6次
【问题探究2】在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
避免接种环温度太高，杀死菌种。
【问题探究3】在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
培养、分离出特定微生物
鉴别不同种类微生物
【注意】病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能
利用人工培养基来培养。
一、培养基的配制 4.培养基的营养构成：（1）基本成分
一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等。
组分牛肉膏蛋白胨 NaCl
H2O
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
含量
怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
研究和应用微生物的前提，发酵工程的重要基础：防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。
在实验室培养微生物： ①为微生物提供合适的营养和环境条件 ——培养基
②确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。 ——无菌技术、微生物的纯培养

第三章微生物实验技术应用实例ppt课件

neutral red:pH红6.8-8.0黄橙
Uninoculated Plate
LACTOSE FERMENTERS: RED/PINK COLONIE
Escherichia coli；Enniae
NON-LACTOSE FERMENTERS: COLOURLESS COLONIES
100
10-1
10-2
1ml
1ml
1ml
LST肉汤管
（36±1）℃培养（24±2）h
初发酵试验操作图示
6 操作步骤
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃ 培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的 MPN值。
6 操作步骤 6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
第三章微生物实验技术应用实例
实例1
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms

《微生物实验技术》课件

利用显微镜观察微生物的形态、大小、细胞结构等特征。
显微镜观察
通过染色技术，使微生物细胞着色，以便更清楚地观察其形态和结构。
染色观察
分类
根据微生物的形态、生理生化特性等，将其归入相应的分类单元的过程。
鉴定
利用各种方法和技术，对微生物进行种、属、种的鉴定，确定其具体分类地位。
03
微生物实验技术方法
总结词
对微生物基因组进行序列比对和分析，了解基因组的组成和结构。
基因组序列分析
利用生物信息学方法对微生物进行系统发育分析，了解其进化关系。
系统发育分析
通过预测基因功能，了解微生物的代谢和生命活动特点。
功能基因预测
04
微生物实验技术的应用案例
微生物检测
在食品工业中，微生物检测是确保食品安全的关键环节。通过实验技术，可以检测食品中的细菌、霉菌等微生物，评估食品的卫生质量。
微生物治理
05
微生物实验技术的安全与防护
A
B
C
D
建立实验室准入制度，确保只有具备相应资格和授权的人员才能进入实验室。
实验室准入制度
定期对实验室进行内务管理，确保实验室环境符合安全卫生要求。
实验室内务管理
根据微生物的危害程度，对实验室进行生物安全等级划分，并采取相应的管理措施。
生物安全等级管理
制定应急处理预案，并定期进行演练，确保在紧急情况下能够迅速、有效地应对。
应急处理措施
01
03
02
04
穿戴个人防护用品
在实验过程中，应穿戴符合要求的个人防护用品，如实验服、口罩、手套等。
避免直接接触
尽量避免直接接触微生物及其培养物，如需接触，应采取相应的防护措施。

微生物实验课件

8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37℃温室培养24h，无菌生长者方可使用。
斜面制作
培养基分装
包扎成捆挂标签
（4）关键步骤及注意事项 ①要严格按配方配制。 ②调pH不要过头。 ③干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，
28℃恒温箱中培养。24h后观察结果(注意：若具
有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散、反之则细而密)。
(3)穿刺接种方法如下： 1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌。 4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却。再用接种针的针尖沾取少量菌种。 5)接种有两种手持操作法。一种是水平法，它类似于斜面接种法。一种则称垂直法。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。
(3)操作步骤：
1）称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2）加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若
掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。
熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

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6 操作步骤
6.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤）。
36℃±1 ℃培养24 h±2 h。
观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
－
肺炎克雷伯氏菌Ⅰ －
－＋
＋
－－－
－
肺炎克雷伯氏菌Ⅱ ＋
－＋
＋
－－－
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阴沟肠杆菌
＋
－＋
＋
－＋/－＋
－
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备及材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 3.4 天平：感量0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.11 菌落计数器。
大肠菌群生化特性分类表
大肠艾希氏菌Ⅰ 大肠艾希氏菌Ⅱ 大肠艾希氏菌Ⅲ
靛基质甲基红 V-P 枸椽酸盐 H2S
＋
＋－
－
－
－
＋
－
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＋
＋－
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明胶
－－－
动力
＋/－＋/－＋/－
44.5 ℃乳糖
＋－－
弗氏柠檬酸杆菌Ⅰ －
＋－
＋＋/－－＋/－
－
弗氏柠檬酸杆菌Ⅱ ＋
＋－
＋＋/－－＋/－
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
1 范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义 2.1 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。 4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。 4.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。 4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。 4.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
微生物实验技术应用实例
实例1
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms
2010-03-26 发布
中华人民共和国卫生部发布
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。
100
1ml
10-1
1ml
10-2
1ml
LST肉汤管
（36±1）℃培养（24±2）h
初发酵试验操作图示
Байду номын сангаас
6 操作步骤
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃ 培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
2010-06-01 实施
GB 4789.3—2010
前言
本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。本标准与GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下： ——修改了标准的中英文名称； ——“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU～150 CFU”； ——删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.32003、GB /T 4789.3-2008。
6 操作步骤
6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
第一法大肠菌群MPN 计数法
5 检验程序
6 操作步骤
6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的 MPN值。
LST肉汤管
复
发
酵
试
BGLB肉汤管
（36±1）℃培养（48±2）h
验操
作
图
示
100
1ml
10-1
1ml
10-2
1ml
三步法大肠菌群检验的全过程及结果判断