浙江大学生物化学丙实验报告6

实验报告

课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________

实验名称： 质粒DNA 的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）

五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理

七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法；

2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；

3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。

二、实验内容和原理 1、实验内容

①质粒DNA 的提取

②DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定

2、实验原理

①质粒：

质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA

分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。

②从细菌细胞中抽提质粒DNA 的步骤：

a 细菌培养使质粒大量扩增；

b 收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ；

c 进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。

③碱裂解法来分离纯化质粒DNA ：

在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ），

使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细

胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。

④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:

DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。

⑤影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：

DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移率越小。

DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA。

胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；

电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度）。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm 电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。

电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。

碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大。

⑥质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度：

环形双链DNA分子有三种构型。

第一种是共价闭合环状DNA，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快；

第二种是开环DNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条

核苷酸链中只有一条保持完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢；

第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。

这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。

⑦实验有关试剂的作用：

溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。

溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。

溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。高盐的3mol/L NaAc/KAc有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。

酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。

氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。

70％的乙醇——用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。

RNaseA——用于消化质粒DNA溶液中的残余RNA。

三、实验材料与试剂