高效液相色谱1
高效液相色谱
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项高效液相色谱的工作原理及操作注意事项一、高效液相色谱的工作原理高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要应用于化学、生物、医药等领域。
其工作原理是利用不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡，实现对待测组分的高效分离。
以下是高效液相色谱的工作原理：1.流动相：高效液相色谱中的流动相也称为溶剂或载体，是携带待测组分通过色谱柱的介质。
流动相的选择应根据样品的性质、检测器的类型以及分离效果等因素进行选择。
2.固定相：高效液相色谱中的固定相是色谱柱中的填料，通常是涂布在硅胶或氧化铝等载体上的高分子聚合物。
不同物质根据其在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。
3.洗脱过程：在高效液相色谱中，待测组分随流动相通过色谱柱，经过固定相和流动相之间的分配平衡实现分离。
分离后的组分会按照其在固定相和流动相之间的分配系数依次流出色谱柱，进入检测器进行检测。
4.检测器：高效液相色谱中使用的检测器根据待测组分的性质和检测要求进行选择，常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器的作用是将组分的浓度转化为可测量的电信号，以便进行记录和分析。
二、高效液相色谱的操作注意事项在使用高效液相色谱进行实验操作时，需要注意以下事项：1.样品准备：在进行高效液相色谱分析前，需要对样品进行必要的处理和制备。
应尽可能避免样品中的杂质和干扰物质对分离和分析的影响。
同时，样品的浓度应适中，以避免色谱柱过载或检测器过载。
2.流动相选择：流动相的选择对高效液相色谱的分离效果和分析结果至关重要。
应根据样品的性质、实验要求以及分离效果等因素选择合适的流动相。
同时，应注意流动相的纯度和稳定性，以保证实验结果的可靠性。
3.色谱柱选择：高效液相色谱中使用的色谱柱是分离和分析的关键元件。
应根据样品的性质、待测组分的类型以及分离要求等因素选择合适的色谱柱。
同时，应注意色谱柱的粒径、孔径和填料性质等参数，以确保达到最佳的分离效果。
高效液相色谱习题及答案 (1)
高效液相色谱法习题一、思考题1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么?4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？16．以液相色谱进行制备有什么优点？17．在毛细管中实现电泳分离有什么优点？18．试述CZE的基本原理19．试述CGE的基本原理20．试述MECC的基本原理二、选择题1．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。
A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相钻度较小D 柱温低3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。
高效液相色谱考题（一）
高效液相色谱考题（一）第一章高效液相色谱法练习一．判断对错1）液液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（）2）正相分配色谱的流动相极性大于固定相的极性。
（）3）反相分配色谱适合于非极性化合物的分离。
（）4）液相色谱固定相通常粒度为5-10微米。
（）5）示差折光检测器是属于通用型检测器，适于梯度洗脱。
（）6）在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（）7）液相色谱的流动相又称为淋洗液，改变淋洗液的组成、极性可显著改变组分分离效果。
8）在液相色谱中，流动相的流速变化对柱效影响不大。
（）9）色谱归一化法只能适用于检测器对所有组分均有响应的情况。
（）10）检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（）二．填空题1）高效液相色谱中的技术类似于气相色谱中的程序升温，不过前者连续改变的是流动相的，而不是温度。
2）在液液分配色谱中，对于亲水固定液采用流动相，即流动相的极性固定相的极性称为正相分配色谱。
3）以ODS键合固定相，甲醇-- 为流动相时，该色谱条件为色谱。
4）在液相色谱中，为改善分离度并调整出峰时间，可通过改变流动相和______的方法达到。
5）在正相色谱中，极性组分先出峰，极性组分后出峰。
三、选择题1）液相色谱适宜的分析对象是（）A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所以有机化合物D 所有化合物2）液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的。
A 改变流动相的种类B 改变固定相的类型C 增加流速D 改变填料的粒度3）在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）A 异构体B 沸点相近，官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样4）用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇—水为流动相时，样品的容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的方法是（）A 增加流动相中甲醇的比例B 增加流动相中水的比例C 流动相中加入少量HAcD 流动相中加入少量的氨水5）如果样品比较复杂，相邻两峰间距离太近或操作条件不易控制稳定，要准确测定保留值是有一定的困难时，可选择一下方法（）定性。
高效液相色谱 质谱 原理
高效液相色谱质谱原理高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种在液相中进行物质分离和分析的技术。
其原理是基于样品在固定的固相填料上与流动相之间进行相互作用，根据它们在填料上的相对亲和性的差异，在流动相携带下进行分离。
在HPLC中，液相为流动相，样品以溶液形式加载到流动相中。
流动相通过一个带有固定填料的柱子，称为液相色谱柱。
填料通常是由细小颗粒构成的，具有较大的内表面积。
当流动相通过色谱柱时，样品中的各组分会因与填料的相互作用而在填料表面停留更长或更短的时间。
这样，样品中的各组分会按照它们的亲和性被逐渐分离。
HPLC可以通过调整流动相的性质，如溶剂的组成、流速和温度等参数，来控制分离的效果。
在分离完成后，可以通过检测器来检测到样品中各组分的信号，如紫外检测器或质谱检测器。
其中，紫外检测器通过测量样品在紫外光的吸收来确定各组分的浓度；质谱检测器通过离子化分析物质并根据质量-电荷比来鉴定和定量样品中的化合物。
质谱（Mass Spectrometry，MS）是一种通过将样品中的分子离子化并在磁场中按照质量-电荷比进行分离和检测的技术。
质谱仪由离子源、质量分析器和检测器等组成。
在质谱中，样品首先被离子源离子化，然后形成离子流，经过质量分析器的分离作用，离子按照它们的质量和电荷比被分离并产生不同位置的电流信号。
最后，检测器对这些电流信号进行放大和记录。
质谱的原理基于离子在磁场中运动的轨迹受到质量-电荷比的影响。
不同质量的离子在磁场中的运动轨迹也不同，从而实现了对离子的分离和检测。
质谱的输出结果一般是一个质谱图，横轴表示质量-电荷比，纵轴表示信号强度或流量。
通过结合HPLC和质谱技术，可以实现物质的高效分离和精确的化合物鉴定。
这种技术在药物分析、环境分析、食品分析等领域得到广泛应用。
实验一高效液相色谱法测定萘
2. 标准溶液配制； 3. 样品溶液的配制； 4. 进样并记录色谱图
五、数据处理与分析
Pi(%)A Asi ms100
实验 二 内标法测定联苯
一、实验目的
1. 进一步熟悉高效液相色谱仪的基本构造与一 2. 般使用方法；
2. 理解内标法的测定原理和优点；
3. 初步学会设计色谱法进行样品测定的实验步 骤，并以萘为内标物测定样品中联苯的含量。
1.00
定容（mL)
10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
10.0
C（ppm）
0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
X1
X2
五、数据处理与分析
1. 标准曲线的绘制：以苯甲酸钠系列标准溶液 的吸光度为纵坐标，相应的浓度为横坐标， 绘制作A-C标准曲线。
2. 样品溶液中苯甲酸钠含量计算：从A-C标准 曲线上查出X值，从而求出样品中苯甲酸的 含量。
选 择）”检查负高压与±15V电源是否正常。
3. 点火 ⑴关紧主机上各气体调节针阀，将“空气-笑 气” 钮旋至“空气”，开排废气装置； ⑵开空压机，调空气输入压为2～3kg·cm-2； ⑶打开助燃气针阀，开大至限压开关被启动 后，调助燃气流量； ⑷依次打开乙炔钢瓶总阀、分阀，调节乙炔 输出压力0.8 kg·cm-2，调燃气流量后点火。
4. 测定 依次从低到高浓度测定标液和样液（最佳条件
选择方法见说明书）。
5. 关机 ⑴“状态检查（工作选择）”置“T（能量）”，
吸喷蒸馏水1min，清洗燃烧器；
⑵依次关乙炔钢瓶总阀、分阀和主机燃气针阀； ⑶依次关空压机、辅助气和助燃气针阀； ⑷关灯电源、总电源，其它复原。
6. 注意事项 ⑴仪器废液管应加水封，换灯或调试时，“状
高效液相色谱法介绍(一)
使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用 一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的 作用，常用的溶剂组合 洗脱剂：一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为： 石油迷<己烷<苯<乙醚<THF（次氢呋喃）<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
七、常见故障的排除
故 泵启动不良
障
故 障 原 因 （1）溶剂水平面太低 （2）溶剂中有气泡析出 （1）色谱柱超负荷 （2）非缓冲流动相使酸性 或碱性样品的色谱峰 发生拖尾 （1）柱子超负荷 （2）样品组分在柱子上积 聚，柱子沾污柱效变 坏 （3）柱填料与流动相未完 全达到平衡 （1）柱子被玷污，柱效下 降 （2）固定相流失 （3）梯度系统对色谱柱 （固定相）不合适. （4）柱温过高 （5）流动相强度太高
峰形不好，出现平头峰或拖 尾峰
分离度下降
保留时间减少
故
障
故 障 原 因 （1）温度不稳 （2）泵启动不良 （3）溶剂中有气泡 （1）长时间的基线漂移可 能由于室温波动引起 （2）池座垫圈漏液 （3）流通池污染 （4）UV灯不亮 （1）样品阀，进样垫或注 射器被污染 （2）溶解样品溶剂的洗脱 峰 （3）样品溶液中有气泡 （4）梯度洗脱溶剂不纯 （特别是水） （1）电源线内部折断 （2）灯启动器有毛病 （3）UV灯泡有毛病 （4）保险丝断开
a.光源（氘灯）发出的光经聚光透镜聚焦，由可旋转组合滤光片滤 除杂散光，再通过入口狭缝至下面反射镜，经反射到达光栅，光 栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波（190nm~600nm） 的单色光经平面镜反射，反射至分束器时，透过光分束器的光通 过样品的流通池，最终到达检测样品的光电二极管测量；被光分 束器反射的光到达检测基线波动的参比光电二级管；当获得测量 和参比光电二极管的信号差，即为样品的检测信息。 b.可变波长紫外吸收检测器的某一时刻只能采集某一特定波长的 吸收信号。 光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加以控制，以便于采 集某一特定波长的吸收信号，并可使色谱分离过程洗脱出的每 个组分峰都获得最灵敏的检测。
高效液相色谱
应用
由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工 业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用 极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化 合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固 醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。
液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统由 两相——固定相和流动相组成。液相色谱的 固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或 在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换 树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均 匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称 现代液相色谱。
敏感，且不适于梯度淋洗。
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
荧光检测器
许多有机物具荧光活性， 尤其是芳香族化合物具有很 强的活性。荧光检测器是一 种选择性很强的检测器，其
灵敏度比UV检测器高2～个数
量级。
电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电 阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
流程及主要部件
流程
高效液相色谱法(1)
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O H3C-C-N-C-O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
为了获得合适的溶剂强度(极性),常采用二元或 多元组合的溶剂体系作为流动相.
采用的溶剂可分为底剂及洗脱剂两部分
底剂决定基本的色谱分离, 洗脱剂具有对组分选择性分离
正相色谱中底剂采用低极性溶剂,洗脱剂选择极 性较强的溶剂.
反相色谱中底剂采用强极性溶剂(水),洗脱剂选 择极性较弱的溶剂(有机溶剂).
离子交换色谱主要在含水介质中进行,组分保 留值可以用流动相中盐的浓度和 pH来控制,增加 盐的浓度导致保留值降低,由于流动相离子与交 换树脂相互作用力不同,因此流动相中离子类型 对样品组分的保留值有显著影响.
30KD
50KD
15
20
25
30
Ion Exchange Chrom
protein B protein B Prot ein B
Prot ein A
-- Na+ SO3+ CM
Prot ein B Pro tei nA
常用填料： 磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸 酯、表面改性硅胶等… 分类： 阳离子交换、阴离子交换
反相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；机理-被分离
物的与固定相的疏水相互作用力的差别；流动相-极性的有机溶 剂或水；分离-范围最广。
RPC
中国药典版--高效液相色谱法
色谱条件与系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用 性试验，即用规定的对照品对仪器进 行试验和调整，应达到规定的要求； 或规定分析状态下色谱柱的最小理论 板数、分离度、重复性和拖尾因子。
（1） 色谱柱的理论板数
色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入 供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液， 记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰 的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应 取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按 n=5.54(tR／Wh/2)<2>计算色谱柱的理论板数， 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长， 载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板 数达到要求。
(3) 拖尾因子
为保证测量精度，特别当采用峰高 法测量时，应检查待测峰的拖尾因子 (T)是否符合各品种项下的规定,或不同 浓度进样的校正因子误差是否符合要 求。除另有规定外， (T) 应在0.95～ 1.05之间。
四重复性
取各品种下的对照溶液，连续进样5次， 除令有规定外，其峰面积测量值相对 标准偏差应不大于2.0％。也可按照规 定 配制相当于80％、100％和120％的 对照品溶液，加入规定量的内标溶液， 配成三种不同浓度的溶液，分别注样3 次,计算平均校正因子，其相对标准偏 差应不大于2.0％。
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约 170cm，柱径0.9cm，流动相速度为 30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20 种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh 之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的 Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗 脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组
3.测定法
定量测定时，可根据样品的具体情 况采用峰面积法或峰高法。但用归一 法或内标法测定杂质总量时，须采用 峰面积法。
高效液相色谱
2 高效液相色谱仪
储液器 真空脱液器
高压泵
自动进样器 柱温箱
检测器 馏分收集器
图1 高效液相色谱仪示意图
由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统 组成。
进样系统
分离系统
高压输液系统
图2 高效液相色谱仪示意图
数据处理系统
检测系统
HPLC组成 主要部分：高压输液系统、进样系统、分离 系统和检测系统。
100mg
1g
高效液相色谱与经典液相色谱比较
➢ 与经典液相色谱的工作原 理相同，但使用效能却远 大于经典的液相色谱；
➢ 高效液相色谱又被称为 现代液相色谱。
（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效 可达30000块/m理论塔板数；
（2）高灵敏度：在高效液相色谱中常使用的紫外吸收检测 器的最小检测量可达10-9g，而荧光检测器的灵敏度可达10-11 g，非破坏性；
2.2 进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，把分 析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
微量注射器
定量管
采样
进样
六通阀进样器工作原理示意图
手动进样阀
定量管 接头
柱外效应
柱外展宽（柱外效应） ：色谱柱外的因素所引 起的峰展宽。主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。可分柱前和柱后展宽。
高效液相色谱
1 概述
高效液相色谱法（HPLC， high performance liquid chromatography）发展于20世纪60年代末；
它不受样品挥发性的限制，可完成气相色谱法不 易完成的分析任务；
适于分析沸点高、难气化、分子量大、受热不稳 定的有机化合物、生物活性样品，这些化合物约 占有机化合物ห้องสมุดไป่ตู้80％。
高效液相色谱分类1.ppt
表面吸附水完全失去，硅胶上只剩下表面羟基，相邻羟 基形成氢键，表面吸附活性最强
200－400℃：
硅羟基脱水成硅氧烷基
700℃：
全部硅羟基不可逆变为硅氧烷基
6
7
硅胶的重要性质
比表面积：多孔固体的比表面积Sp＝外表面Se和内 表面Si之和，比表面积越大，溶质的保留值越大。 孔径与比表面积成反比。比表面积越大，孔径越小。 根据孔径大小，硅胶可分为：小孔硅胶（<2nm）大 孔硅胶（>50nm）和中孔硅胶（2到50nm）小孔硅 胶对分子量大的溶质会产生排阻现象。而且表面积 上的游离硅羟基数也减少。所以小孔硅胶可能造成 不可逆吸附。
正相分配色谱：以极性物质作为固定相，非极性溶剂作 流动相的液液色谱，称为，适合于分离极性化合物；
反相分配色谱：选用非极性物质为固定相，而极性溶剂 为流动相的液液色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、 稠环芳烃及烷烃等化合物。
20
键合相色谱
液液色谱尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相， 但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动 相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失。 70年代初发展了一种新型的固定相—化学键合固定 相。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机 基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替 机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相 流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了 分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有 类型的化合物。
目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法， 大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种 认为属于吸附色谱。
在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性 小的组分后流出。
29
30
流动相
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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型号规格： 5μm, 75x50(内径x长度,μm x mm)，120A
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硅胶颗粒
粒径: 1.8, 2, 3, and 5 μm 孔径: 120, 200 and 300 A PS/DVB颗粒 粒径: 1, 1.7, 3, and 5 μm 孔径: 无孔, 100, and 300 A 固定相结构: 聚苯乙烯 离子交换 (PS/DVB Based) 粒径: 1, 1.7, 3, and 5 μm 孔径: 无孔 广泛的固定相选择
使用高效填料带来两个新问题： ★柱流动阻力大大增大，需要采用高压泵输液 ★表面能很大，采用专业的装柱技术
目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采 用脱机或非连续检测。 ※ HPLC的特征
采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度 检测器, 从而实现了高效、高速和高灵敏度、定 量准确, 达到可与GC相媲美的分离分析性能。 特别是结合计算机技术， HPLC已成为高度自 动化和智能化的现代分析仪器。
历史上出现不同的HPLC名称： ★高压液相色谱 (High Pressure Liquid Chromatography) ★高速液相色谱 (High Speed Liquid Chromatography) ★高效液相色谱(High Performance Liquid
Chromatography)
从速率理论得到塔板方程：
H
2dP
2DM
u
d
2 P
DM
u
k
(1 k)2d2 P NhomakorabeaDM
u
qk d 2f (1 k)2 Ds
u
涡流扩散、流型效应和停滞流动相慢传质均与dp 有关，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要 特征是颗粒细小。
固定相的慢传质与df有关，减少df有利于提高柱 效。键合相色谱有效降低df，柱效进一步提高。
高效液相色谱法 (HPLC)
一. 与经典LC的比较 二. 色谱柱 三. 流动相 四. 检测器 五. 分 类
一. 概 述
HPLC是在经典液体柱色谱的基础上, 在色谱理论 指引下，加以改进而发展起来的。特别是GC迅速成 为一种仪器分析方法和社会需要分离分析难挥发复 杂样品促进了HPLC的发展。近年来它以6-8%的增 长率发展，目前年发表论文数已超过GC。2000年仪 器销售全球第一。
硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下： （最常见类型！）
+ Si OH
ClSiR3
(ROSiR3)
制备技术:
硅胶整体柱，如Merck 公司的Chromolith Performance RP C18、Silica ROD 和Prep ROD； 有机聚合物整体柱，如BIA Separations 的CIM(Convective Interaction Medai)等聚合物整体柱
应用：
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色谱 (μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药物 学、环境科学等领域的分离分析。
表1 三种不同形式液相色谱的这样特征
特性 进样
经典LC TLC/PC
人工加样
点样
HPLC 进样器
HPLC 优势
准确
溶液流动
重力
表面张力
检测和定量 收集馏分检 测
实验结果 棒式图
显色 斑点
高压泵 连续检测
色谱图
快速分离, 重现性好
高灵敏度, 自动化
五高一广
HPLC和经 HPLC和经典LC主要差别在于高 典LC比较 效固定相、输液设备和连续检测。
色谱柱的选择应考虑： ➢ 固定相类型的选择, 主要取决于样品分离模式； ➢ 柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比 表面、平均孔径和孔容等； ➢ 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度 ➢ 色谱柱的牌号/厂商。
色谱柱的结构
色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组 成。应特别注意柱头规格及无死体积连接的特性。
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
1．填料的特性 1）基质材料 ① 无机基体：硅胶、氧化铝、氧化锆和二氧化钛等 ② 交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等 ③ 复合材料：无机基体复合一层聚合物 2）形状：球形和不规则
※ 经典LC填料的缺陷 填料通常是粒度大、范围宽、不规则, 不易填
充均匀, 扩散和传质阻力大, 谱带展宽加大。它 存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。 ※ HPLC填料（高效固定相）
颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传 质阻力小, 分离效率高。早期HPLC的固定相用 涂渍的方法制备，df大，这和GC一样，会大大 降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料多用键合 固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱 效。
柱规格
制备柱
分析柱
微径柱液相色谱 (Microbore HPLC)
毛细管液相色谱 (Capillary HPLC)
快速柱：高效短柱，如4.6×30mm, 3mODS柱
整体柱（Monolithic column)
产品名称： SCX-NP5毛细管液相色谱柱（货号：401NP5-0005）
产品样本： 下载
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简便，填料一次使用。
二. 色谱柱（固定相、填料）
色谱柱是色谱仪的心脏（起分离作用），其核心是优 质固定相（填料）。进行色谱分离的首要工作是选择 性能良好的色谱柱，即在确定的分离条件下分离效率 高和分析时间短的色谱柱。
首创了2 μm以下的 离子交换相 离子交换柱具有空前的效率和分辨率
PS/DVB反相pH范围 1-14 ，离子交换相pH范围 2-12 高速，高覆盖率，高稳定性
应用
蛋白组学研究
蛋白质分离和分析
多肽分离和分析
整体柱(monolithic column) 是一种用有机或无机聚合 方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相,具有制 备简单、重现性好、多孔性优越、能实现快速、高效 分离等优点。