免疫印迹技术课稿PPT精品课件

▪ 膜的选择根据：
▪ a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能 结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大 小）；
▪ b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方 法，信噪比好）；
▪ c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱 分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合
在硝酸纤维素膜上。
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▪2、抗原转移
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二、基本操作流程
2、抗原转移
转移膜的选择
▪
Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸
纤维素膜（NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜），此外也
有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
▪
最常用的封闭剂就是脱脂奶粉。
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各种常见的封闭剂
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二、基本操作流程
▪ 4、免疫检测
▪ 把已经封闭过的膜放入加入已知抗体 的缓冲液中，对特异性的靶抗原进行检测。
▪ 这个过程通常会发生多步反应，一般 采用间接检测法，常用的检测系统有放射 性同位素、酶、荧光素等，通过放射自显 影或显色反应检测抗原-抗体复合物，从而 达到对蛋白质进行特异性检测和鉴别的目 的。
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二、基本操作流程
▪ 3、封闭
▪
电泳转移后，固相纸膜上还留有无蛋白组分
结合的区域，在对蛋白质进行专一性检测的时候，
由于免疫学检测试剂中的蛋白质（抗体），在与
特异性抗原结合的同时也会非特异的结合固相上
的空白区域，产生高背景，导致检测结果不明显， 因此要对这些空白区域进行封闭。
▪
同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一
般也可以说明问题。
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二、基本操作流程
▪ 2、抗原转移
▪
通常有两种方法：毛细管印迹法（转移效率
较低）和电泳印迹法（常用）。
▪ 电泳印迹法-----用有空的塑料盒有机玻璃板
将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”状，而后
浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选
且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条
件）。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件
下可以稳定保存很长时间。
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二、基本操作流程
2、抗原转移 NC膜简介
但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不 适合用于需要多次重复清洗的用途。选择 缺 硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通 常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的 膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如 果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。
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原
理
流
程
图
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三、注意事项
▪ 1． 免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对 含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白， 只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细 胞相比蛋白的含量是高还是低。
▪ 2． 比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞 不同条件下的相对含量时，各样品的总蛋白量必 须相等。
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二、基本操作流程
2、抗原转移
NC膜简介
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▪ 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用
的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力
优
强，适用于各种显色方法（包括同位素， 化学发光、常规显色、染色和荧光显色），
背景低，性价比高；使用也很简便（不需
要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排
出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而
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二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE
▪ ①收集或提取蛋白样品
▪ ②测定蛋白样品浓度
▪ ③电泳
▪ 配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品 中加入上样缓冲液，点样后接通电源开始 电泳。
▪ 利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效 应将不同分子量大小的蛋白质分离。
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二、基本操作流程
应对靶物质进行检测。
▪
蛋白质的Western blotting技术结合了凝胶
电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多
种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－
100pg）中等大小的靶蛋白。
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二、基本操作流程
1、SDS-PAGE
④
电泳结果检查
③
电泳
②
测定蛋白样品浓度
①
收集或提取蛋白样品
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基本内容
1 免疫印迹技术的原理
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基本操作流程
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注意事项
4 免疫印迹技术的应用
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课堂小结
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作业
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一、免疫印迹技术的原理
▪
通过SDS-PAGE区分不同大小的蛋白组分，并
转移至固相支持物（硝酸纤维素膜），通过特异
性试剂（抗体）作为探针，与固相支持物上的蛋
白质（抗原）发生抗原抗体反应，再通过显色反
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二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE
▪
①收集或提取蛋白样品
▪
可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬
浮细胞或组织样品。
▪
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞
核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样
缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白。
▪
另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解
▪ 1、SDS-PAGE
▪
①收集或提取蛋白样品
▪
②测定蛋白样品浓度
▪
③电泳
▪
④电泳结果检查
▪
考马斯亮蓝使用简便快速，是最经济通用的
蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但
分辨率高很多。可是由于考马斯亮蓝染色或者银
染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western
Blot实验，很多人会选择省略掉这一步。
法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取
这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽
提.
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二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE ▪ ①收集或提取蛋白样品 ▪ ②测定蛋白样品浓度 ▪ 一般来说有三种方法：第一种是采用
定量试剂盒；第二种是采用光学检测法； 第三种直接跑SDS-PAGE。
第11讲
免疫印迹技术
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雕版印刷是最早在中国出现的印刷形式，在 印刷史上有“活化石”之称，扬州是中国雕版印 刷术的发源地，是中国国内唯一保存全套古老雕 版印刷工艺的城市。
雕版印刷术是一种具有突出价值且民族特征 鲜明、传统技艺高度集中的人类非物质文化遗产。 它凝聚着中国造纸术、制墨术、雕刻术、摹拓术 等几种优秀的传统工艺，最终形成了这种独特文 化工艺；它为后来的活字印刷术开了技术上的先 河，是世界现代印刷术的最古老的技术源头。