样品前处理技术

青霉素的分配平衡
青霉素结构式
青霉素结构式
实验室溶剂萃取过程
分液漏斗
有机相 水相
溶剂萃取步骤
Gas
振荡几次
打开活塞
溶剂体积为样品 溶液的30％-35％。
蒸气逸出（也叫放气）
静置分层 有机相 絮状物 （乳化） 水相
激烈振摇 1 - 2min
水相和絮状物
有机相
3～ 5次
萃取步骤及方式
工业上萃取操作通常包括三个步骤：
一般生化物质的萃取在室温或较低温度下进行
盐 析作用
无机盐的作用：
生化物质在水中溶解度↓，有利于溶
质向有机相中分配。
有机溶剂的选择
根据相似相溶的原理，选择与目标产物极性相
近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大的分配 系数； 有机溶剂与水不互溶，与水有较大的密度差， 黏度小，表面张力适中，相分散和相分离容易； 应当价廉易得，容易回收，毒性低，腐蚀性小， 不与目标产物反应。 常用于生化萃取的有机溶剂有丁醇、丁酯、乙 酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等。
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2、样品净化
L - L分配
原理：化学平衡下的分配定律
提取效率： 根据分配系数可以计算等体积或不等体积的效率
影响因素：
溶剂的“相似相容”原理、少量多次原则； pH对具有一定酸碱性的化合物的分配系数的调节； 离子对试剂的作用 盐的作用
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二、萃
取 extraction
本节主要内容
1.有机溶剂萃取 2.反胶束萃取 3.超临界流体萃取 4.双水相萃取
乳化
乳化：水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或
水相中的现象。
这样形成的分散体系称乳浊液。
乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现
夹带，收率低，纯度低。
有机相
乳化现象
水 相
乳化层
乳状液类型
水包油（O/W）型
油包水（W/O）型
水包油（O/W）型
油包水（W/O）型
发酵液乳化的原因：
a 蛋白质的存在，起到表面活性剂 b 固体粉末对界面的稳定作用
反胶束（reversed
micelles）是表面活性剂在非 极性有机溶剂中亲水性基束自发地向内聚集而 成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级 的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的， 并具热力学稳定的有序构造。
反胶束的形成
(CMC):表面活性 剂中水溶液中形 成胶团的最低浓 度critical micelle concentration

有机溶剂萃取法 solvent extraction
有机溶剂萃取又称为溶剂萃取，利用样品中不同 组分分配在两种互不相溶的溶剂中的溶解度或分 配比不同来达到分离、提取或纯化的目的。
料液 ｝ 稀释剂Ｂ
溶质Ａ
萃取液Ｓ＋Ａ(B)
溶剂Ｓ
萃余液Ｂ＋Ａ(s)
Light phase（萃取相）
溶质 萃取剂
原溶剂 杂质 Heavy phase（萃余相）
乳浊液的破坏措施
物理法：过滤、离心沉降、加热，吸附，稀释 * 转型法 加入一种乳化剂： ①水包油（O/W）型 ，加入亲油性表面活性剂 ②油包水（W/O）型，加入亲水性表面活性剂（十二烷酸 苯磺酸钠） 控制条件不允许形成相反的乳浊液。 * 顶替法 加入一种乳化剂，将原先的乳化剂从界面顶替出来： ① 形成的乳浊液类型与原来的一致 ② 它本身的表面活性 > 原来的表面活性 ③ 不能形成坚固的保护膜。

反胶束溶解蛋白质模型
水壳模型 吸附模型
强烈疏水区
溶解模型
半岛模型
反胶束萃取操作
1.液液接触法 即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触。 2.注入法 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的 非极性有机溶剂中去。这种方法的过程较快并可控制 反胶束的平均直径和含水量。 3.溶解法 对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶束（ W＝3～ 30 ）的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白 质进入反胶束中，该法所需时间较长。含蛋白质的反 胶束也是稳定的。
样品前处理技术
1、样品提取 提取（extraction）是采用物理的或化学的
手段破坏待测组分与样品成分间的结合力，
将待测组分从样品中释放出来并转移到易
于分析的溶液状态。
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样品前处理技术
1、样品提取
提取溶剂： 极性：
官能团 : -COOH > Ar-OH > -OH > NHCOR > -NH2 > -SH > -CHO > -CO- > COOR > -N (CH3)2 > -NO2 > -X > -OR > CH=CH > CH2
静电引力：主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内表 面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力作 用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减小 大分子蛋白进入胶核的传质阻力。 凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增大 的因素均有利于提高分配系数。 这些因素主要是pH、离子强度、表面活性剂种类 和浓度、助表面活性剂等
1、样品提取
强化溶剂萃取(accelerated-solvent extraction, ASE):
由SFE衍生，采用高温（50-200）高压溶剂作流体
高温可以提高溶剂溶解能力，减弱组分与基质的结合，
降低溶剂粘度，高压可提高扩散系数和传质速度 需要特殊仪器，有11、22、33 mL 三种规格样品管 特点是速度快，效率高，节省溶剂，易于自动化
反胶束特点
0.1～1.0 mmol/L的范围内。在反胶束中有一个极性核心，它包 括由表面活性剂极性端组成的内表面、平衡离子和水，被称之 为“水池”（water pool）。这个“水池”具有极性，可以溶解 具有极性的分子和亲水性的生物大分子
常用的表面活性剂
定义：由亲水憎油的极性基团（亲水基）和亲油憎水的非极性 础
液-液萃取是以分配定律为基础 分配定律：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分 配，平衡时，如果其在两相中的相对分子质量相等，溶质 在两相中平衡浓度之比为常数。 K-分配常数
X 萃取相浓度 K Y 萃余相浓度
在常温常压下Ｋ为常数；应用前提条件
（1） 稀溶液 （2） 溶质对溶剂互溶没有影响 （3） 必须是同一分子类型，不发生缔合或离解
反胶束萃取蛋白质的应用
助表面活性剂（assistant of surfactant ）能改变表 面活性剂的表面活性及亲水亲油平衡性，参与形 成胶束，调整水和油的极性，水溶性醇可减小水 的极性，油溶性醇可增加油的极性，从而影响体 系的相态和相性质的微乳成分。 例如，在配制微乳液时的助表面活性剂主要有乙 醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇 、异戊醇、1-己醇、2-己醇、1-辛醇、2-辛醇、杂 醇油、对壬基酚等。 非离子表面活性剂，使 它们插入反胶团的结构中，就可以增大反胶团的 尺寸，溶解较大相对分子质量的蛋白质。
亲水基 疏水基
表面活性剂
阳离子表面 活性剂 非离子型表 面活性剂 阴离子表面 活性剂
常用阴离子表面活性剂
AOT（Aerosol OT） 化学名称是二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠
常用阳离子表面活性剂
CTMAB（溴化十六烷基三甲铵或十六烷基三甲基溴化铵）
TOMAC（氯化三辛基甲铵）
反胶束萃取蛋白质的原理
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样品前处理技术
1、样品提取
超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE):
19世纪已经有技术，20世纪80年代开始用于分析
根据溶剂具有的超临界流体性质进行萃取
（二氧化碳、氨、甲烷、水等） 需要特殊仪器 特点是速度快，效率高，选择性强，易于净化
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样品前处理技术
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样品前处理技术
1、样品提取
微波辅助萃取(microwave-assisted extraction, MAE):
1986年由Ganzler首次报道
高温可以提高溶剂溶解能力，减弱组分与基质的结合，
降低溶剂粘度，高压可提高扩散系数和传质速度 需要特殊仪器，有11、22、33 mL 三种规格样品管 特点是速度快，效率高，节省溶剂，易于自动化
化合物: 醇 >酮> 酚>芳香胺>酯，不完全 卤代烃>醚>不饱和烃 >全卤代烃>饱和烃
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样品前处理技术
1、样品提取
提取溶剂选择原则：
“相似相溶”原理
具体要求 : 对组分溶解度大，对干扰杂质溶解度小， 与样品基质相容性好（能有效释放药物，具有脱蛋白 和脂肪的能力）沸点适中，粘度小，毒性低，价廉等 常用溶剂: 水、甲醇、丙酮、乙腈、正己烷、氯仿、 乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚等
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样品前处理技术
1、样品提取
超声波辅助提取(sonication - assisted extraction, SAE):
1967年由Johnson 提出
空化作用使分子运动加快，提供能量加快溶解和脱附
一般为密闭容器 操作中，将容器放入超声水浴，数秒后拿出，再放入， 如此反复数次即可 特点是时间短，效率高，可自动化，但耗费溶剂多
含有羧酸、酚、胺和酮四种成分的混合试样， 预分离各组分的乙醚萃取：
混合试样 +NaHCO3水溶液 乙醚萃取 （水相） 羧酸钠 （乙醚层） 酚、胺、酮 +NaOH水溶液 （水相） 酚钠 （乙醚层） 胺、酮 +HCl （水相） 胺盐 （乙醚层） 酮
反胶束萃取法 Reversed micellar extraction
概述

萃取：当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触 时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择 得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转 移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质 （如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样 就能达到某种程度的提纯和浓缩。

反萃取：在萃取分离过程中，当完成萃取操作后，为进 一步纯化目标产物，需要将目标产物转移到水相。这种 调节水相条件，目标产物由有机相转到水相的操作称为 反萃取。 萃取操作不仅可以提取和增浓产物，使产物获得初步的 纯化，所以广泛应用在抗生素、有机酸、维生素、激素 等发酵产物 的提取上。
有机溶剂萃取的影响因素
1）．影响萃取操作的因素：
pH、温度、盐析 2）．有机溶剂的选择 3）．乳化与去乳化
pH的影响
pH对表观分配系数的影响 pH低有利于酸性物质分配在有机相，碱性 物质分配在水相。 对弱酸随pH ↓K ↑
对弱碱随pH ↓K ↓
温度
◆ T↑，分子扩散速度↑，故萃取速度↑ ◆ T影响分配系数： 1）物质 ― T↑ 水中的溶解度↑ ∴ 萃取时 T↓使K↑ 2）T影响弱酸、弱碱的解离平衡 ◆ T影响两溶剂的互溶度影响
混合萃取—分离—溶剂回收 因而工业萃取的流程中须有混合器(如搅拌混合 器)、分离器(如碟片式离心机)和溶剂回收装置 (如蒸馏塔)。 一般萃取过程很快，如果接触表面足够大，则 在15~60 s之内就可完成。 萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。
单级萃取
多级萃取
多级错流萃取流程
多级逆流萃取流程