最新AKTA蛋白纯化系统操作(精品课件)

AＫＴA蛋白纯化系统操作
ＡKＴA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。

AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLＯREＲ、AKTA PＩLＯT、AKTA PＵRIFIER等多种型号的设备.以下以AKTA ＥＸPLORER 为例简单介绍AＫTＡ蛋白纯化系统的一般操作。

1、认识AＫTA.
AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。

该色谱系统的分离装置有三个主要组件,在底部平台的左侧整齐堆起(Fig １).它们是:
FIG 1、ＡＫTＡＥXＰLORＥR主机•Pump—900 为双通道高效梯度泵系列.在AKTAexpｌorer １00,流速范围０.0１-1０0 mｌ/ｍin,压力高达１0 Mpａ（泵名为Ｐ-901).在AＫTA eｘplｏre10，流速范围0。

０0１-10 ml/min，压力高达２5
Mpa（泵名为P—903)。

• Moｎitor ＵＶ—900，同时监控１90－70０ nm 范围内高达 3 个波长的多波长紫外—可见（UV-Vis）监测器。

（针对部分ＡＫTＡPURＩＦＩER机型,尚有UPＣ-900监测器可供选择,光源为汞灯光源,一次可以监控一个波长，安装滤光片后,可以在选择的波长范围内进行切换。

)
• Ｍoniｔor pH/C－９00,在线电导和pH 监测的组合监测器。

Ｆｉｇ２、AKTA EXPLORER硬件模式图AKTＡ EXＰLＯREＲ系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig ２)。

组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。

打开装阀的门可全部看到。

柱被挂在装阀的门的外侧。

分离装置由ＵNIＣORN 软件控制。

软件安装于一独立的电脑主机之中,在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU9５０进行控制。

２、一般操作
2。

1 开机
按位于底部平台前左侧的ＯＮ／OＦF 按钮，打开色谱系统,然后打开电脑电源。

待仪器自检完毕(CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁)。

双击桌面上UＮICORN图标,进入操作界面.UＮICORＮ的操作界面分为四个窗口（Ｆｉg 3）
Ｆiｇ3、Ｕnicorn的操作界面
2.2准备工作溶液和样品
所有的工作溶液和样品必须经过0.45µm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用.当缓冲液中含有有机溶剂(如乙腈、甲醇)，需在使用前用低频超
声脱气10mｉｎ.
2.3清洗及管道准备
首先将A泵的进液管道(A1)放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道（B１)放入高盐溶液中,在sys ｔｅm contｒｏl窗口点击工具栏内的mａnuａl，选择 pｕｍp→pｕmp wash expｌorer，选中Ａ1,Ｂ1管道为OＮ, eｘｅcｕte。

泵清洗将自动结束.（Fig 4）
Fig ４、AKTA Exploｒer的泵清洗操作
2．4安装层析柱
在manｕal里选择pump→fｌow ｒａte，输入一定的低流速（Ｆig ５)，ｉnsert；选择Ａｌarm＆moｎ→aｌａrm prｅsｓｕre,设置higｈ alａｒm(输入填料或层析柱的耐受压力，以较低者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到),inｓerｔ，exｅcute(Fig 6） .待InjeｃtioｎVaｌve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头,稍微拧紧后将柱下端
的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。

Fiｇ5、AKTA Exｐlｏrer的流速设定操作
Fig 6、AKＴA Explorer的限压设定操作
2.5开始纯化:
１）在柱子平衡好之后(电导，pH的数值和变化趋势稳定）即开始上样了.此时应将紫外调零（Fｉg 7）,选择Aｌaｒm＆ｍｏn→auｔｏzerｏ，eｘｅcｔｕe.
Fig 7、AKＴA Explorer的紫外调零操作2）具体上样方式:ＡＫTＡ系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等,这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。

点击ｐａuse，将A１放入样品中，点击coｕntｉne，待样品上完后,再将A１放入到平衡液中继续清洗柱子。

3）洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。

在mａnuaｌ里选择pump→grａdｉenｔ,按照自己的工艺选择tarｇetB（100%)和lｅngｔh（１0ＣV）（Fig 8)。

Fig 8、AKTＡ Exｐloｒer的洗脱条件设定操作
4)设定收集:选择Ｆｒac→fractionａtiｏn_900，输入每管收集体积，eｘeｃtuｅ（Fiｇ 9).结束固定体积收集选择Fｒａc→fractionaｔｉoｎ_stｏp＿900，ｅxeｃtｕe(Fig 10)。

Fiｇ 9、AKTA Eｘplｏrer的组分收集设定操作
Ｆig 10、AＫＴA Explorer的组分收集停止设定
操作
5）清洗泵及卸下层析柱:
将A１和B1入口放入纯水中,启动pump wash ｐｕriｆier功能冲洗A泵和B泵及整个管路.然后再将A1和Ｂ1入口放入20％乙醇中,同样操作将乙醇冲满整个管路保存.再给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头.整个过程中应防止气泡进入。

６)关闭电源:
从软件控制系统的第一个窗口uniｃorｎｍana
ｇer点击退出,其他窗口不能单独关闭。

然后关闭AK ＴA主机电源，关闭电脑电源。

3、程序设定操作
在metｈｏｄｅditｏr窗口点击工具栏内的metho ｄｗizard,弹出窗口界面如Ｆig １1所示,可以分别在main selectioｎ、column以及cｏｌuｍn posｉtion三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置，选好之后，点击nｅｘt按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Ｆiｇ 1２)，在此可以设定检测的波长，针对AＫTA EXPLORＥR可以一次选择三个波长共同进行监控,并在此设定Ａ泵和Ｂ泵的溶液进口，设定好之后,点击next，出现如Ｆig 13所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。

Fig 11 Fig 1２
Fig １ 3 Fig 14
完成之后,点击next出现Fig 14的窗口，在此可以
设定上样的条件,可选择的条件包括上样的方式,如上样
环上样以及样品泵上样，对上样的体积也要进行设定.
如果利用系统泵上样,在此无法进行设置,不过可以利用
A泵和B泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。

在上步设置完成之后，点击NＥXT出现如Fig １5所示窗口，这里是针对流穿组分收集所进行一些设置，针对安装的不同的收集器，具体内容可能有些差异,这里显示的界面是在安装了Fｒac—９５0收集器之后所出现的界面，设置完成点击NEXT出现如Fｉg 1６所示的窗口,设置目标组分收集的一些参数，点击ＮＥXT，出现如Ｆiｇ 17所示的窗口，针对具体的洗脱条件可以进行设置。

当全部设置完成之后,点击ｆinish，弹出Ｆig 1８所示的窗口，可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改，完成之后点击按钮,完成程序存盘操作。

至此完成洗脱程序的设定工作,在应用自动洗脱程序时,可在SY ＳTEM CＯＮＴROL窗口点击文件菜单栏中的，在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行，之后会依次弹出一些对话框,主要是再次确认程序的设置条件，并选择洗脱结果文件的保存位置，全部设置完之后，洗脱将自动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中。

Fig 1５Fｉg 1６
Fig 17 Fig 18
４、结果的浏览与简单处理
在纯化完成后，Unｉｃorｎ软件会自动的按照预先的设置保存结果文件,如果没有指定,那么结果文件会保存于一个文件名以manual N开头的文件中，N为系统依次生成的一个１－10之间的数字。

对于结果的浏览应在evaluaｔｉon窗口(Ｆiｇ19）中进行,打开文件及对文件进行普通编辑的菜单如Fｉｇ2０所示.
Fig １9 Evalｕatioｎ窗口
Ｆig ２0 纯化结果普通编辑菜单
这里已经选择了一个纯化文件，打开后，在结果浏览窗口点击鼠标右键，选择propertiｅs，可以弹出如Fiｇ2１所示的操作菜单,可以分别对结果进行编辑，如改变曲线的颜色,设定横轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等。

Ｆig ２1
4、ＡＫTA蛋白纯化系统的日常维护
4。

1 每天，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐浓度洗脱缓
冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用
System Waｓh Meｔｈｏd完成以蒸馏水将系统彻
底清洗,再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再
次投入使用进行实验操作。

用蒸馏水将余下的缓
冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。

此举不
但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因
使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵
塞，对系统构成不必要的损害和损耗。

4.2每周更换润洗缓冲液(２０％乙醇).若发现储液
瓶液体增多，就说明泵内部有漏液，需要更换泵
密封圈。

若发现液体减少,需要检查润洗管接头，
如果没有漏液,则泵膜或密封圈需要更换。

４.３一定要保持实验环境的清洁，以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏.
4.4 在长时间不应用系统进行试验的时候，应将系
统管路充满2０%的乙醇，并关闭紫外检测器，清
洗PH探头，并保存于适当的缓冲液中。

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