第7章 基因功能分析的基本策略
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基因功能研究的整体解决方案
1
BamHI
Sal I
Bgl II
XhoI
Sal I
2
BamHI
Bgl II
XhoI
Sal I BamHI
1
2
Bgl II XhoI
A）miRNA的串联
B ）miRNA串联试验结果
13
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Life Technologies Proprietary & Confidential
|
miRNA载体特点-组织特异性表达miRNA
9
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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BLOCK-iT™ miR RNAi Select
1. BLOCK-iT™ miR RNAi Select ：在Invitrogen网站的数据库里边 有已经设计好了的针对不同基因的oligo DNA（4对/一套）； Oligo DNA可以用来插入到BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression载体里边，进行RNAi研究。
|
RNAi Vector + RNA合成
standard siRNA
(21-mer overhangs)
Stealth™ RNAi
(25-mer blunt)
shRNA expression
miRNA expression
5
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Life Technologies Proprietary & Confidential
|
体外合成RNAi vs. RNAi载体
体外合成RNAi 长效稳定沉默 RNAi载体
可调控的沉默
导入到难转染的细胞 沉默效果快速而强力 最高特异性 容易操作
BamHI
Sal I
Bgl II
XhoI
Sal I
2
BamHI
Bgl II
XhoI
Sal I BamHI
1
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Bgl II XhoI
A）miRNA的串联
B ）miRNA串联试验结果
13
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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miRNA载体特点-组织特异性表达miRNA
9
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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BLOCK-iT™ miR RNAi Select
1. BLOCK-iT™ miR RNAi Select ：在Invitrogen网站的数据库里边 有已经设计好了的针对不同基因的oligo DNA（4对/一套）； Oligo DNA可以用来插入到BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression载体里边，进行RNAi研究。
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RNAi Vector + RNA合成
standard siRNA
(21-mer overhangs)
Stealth™ RNAi
(25-mer blunt)
shRNA expression
miRNA expression
5
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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体外合成RNAi vs. RNAi载体
体外合成RNAi 长效稳定沉默 RNAi载体
可调控的沉默
导入到难转染的细胞 沉默效果快速而强力 最高特异性 容易操作
基因功能分析的基本策略
它旨在揭示基因如何参与生命活动， 以及基因变异如何影响生物体的性状 和疾病易感性。
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
基因分析的基本策略共41页文档
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
基因分析的基本策略
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
《基因功能分析》课件
通过荧光染料或探针标记的特异引 物，对特定基因进行实时荧光检测 ，实现对基因表达的定量分析。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
最新基因功能分析的基本策略
基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶 载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入 在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。
2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常 取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并 保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞 进行筛选。 4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后 将胚泡植入假孕小鼠子宫中； 5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色 体上，可以用Neor基因作探针，通过Southern blot鉴定。 6、杂交育种，获得基因剔除的纯合体小鼠
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk
打靶载体
内切酶消化 线性化打靶载体 转染
基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配 杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配 杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
胚泡
植入
假孕小鼠
第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析
启动子
结构基因
转基因载体
报告基因
注射
增强子
转基因小鼠
Southern blot
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常 取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并 保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞 进行筛选。 4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后 将胚泡植入假孕小鼠子宫中； 5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色 体上，可以用Neor基因作探针，通过Southern blot鉴定。 6、杂交育种，获得基因剔除的纯合体小鼠
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk
打靶载体
内切酶消化 线性化打靶载体 转染
基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配 杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配 杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
胚泡
植入
假孕小鼠
第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析
启动子
结构基因
转基因载体
报告基因
注射
增强子
转基因小鼠
Southern blot
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
基因表达与功能分析基本策略共84页文档
基因表达与功能分析基本策略
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 是活 动。——卢 梭
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 是活 动。——卢 梭
基因分析的基本策略课件
，直接读出DNA序列。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点
试剂
反应ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试剂
G
硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G
G+A 甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
5`-GATCACTACTG-3`
硫酸二甲酯
5`*-GATCACTACTG-3`
G
5`* GATCACTACTG 5`*G
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
G+A 甲酸 C+T 肼
5`*GATCACTACTG
5`*GATCACTACT 5`*GATCACTAC
5`*GATCACTA 5`*GATCA 5`*GA 5`*G
基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S）
； 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、
不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断
开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺
凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开； 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况
定DNA序列的末端中止法；
➢K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法
；
➢M.Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全
都获得了诺贝尔奖。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点
试剂
反应ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试剂
G
硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G
G+A 甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
5`-GATCACTACTG-3`
硫酸二甲酯
5`*-GATCACTACTG-3`
G
5`* GATCACTACTG 5`*G
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
G+A 甲酸 C+T 肼
5`*GATCACTACTG
5`*GATCACTACT 5`*GATCACTAC
5`*GATCACTA 5`*GATCA 5`*GA 5`*G
基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S）
； 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、
不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断
开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺
凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开； 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况
定DNA序列的末端中止法；
➢K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法
；
➢M.Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全
都获得了诺贝尔奖。
基因功能分析策略共95页
基因功能分析策略
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
95
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
95
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
基因分析的基本策略PPT文档共41页
不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
基因分析的基本策略
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
基因分析的基本策略
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
基因功能分析策略
阿根廷占２３％，达１３５０万公顷。 加拿大占６％，达３５０万公顷。 中国第四位，占４％，达２１０万公顷。
欧盟国家总面积不到２０万公顷，０.３％左右。
精选课件
精选课件
各國GMO作物栽培面積的變遷
(藍色者為全球統計)
百 萬 公 頃
精选课件
Research on Transgenic Corn
转基因玉米研究
antigen against an E.coli
toxin.
Part of the Plant Science Institute Biopharmaceutical Initiative
Feeding antigencontaining corn to mice
protected them against E. coli enterotoxin and
精选课件
转基因玉米
抗虫害的玉米
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和 工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如 今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。
精选课件
转基因小麦
从植物体中分离出 合成赖氨酸的基因，把 这基因转入小麦植株中， 培育出转基因小麦。用 这种转基因小麦制造出 来的面粉，更适合用来 烤面包，而且面粉中赖 氨酸含量高，这种面包 的营养价值高。
4．胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射
入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动 物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁 育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。
精选课件
转基因动物的应用前景
1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现 象的内在本质。
2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理 及治疗方法。
欧盟国家总面积不到２０万公顷，０.３％左右。
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各國GMO作物栽培面積的變遷
(藍色者為全球統計)
百 萬 公 頃
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转基因玉米研究
antigen against an E.coli
toxin.
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Feeding antigencontaining corn to mice
protected them against E. coli enterotoxin and
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转基因玉米
抗虫害的玉米
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和 工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如 今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。
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4．胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射
入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动 物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁 育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。
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转基因动物的应用前景
1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现 象的内在本质。
2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理 及治疗方法。
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体上，可以用Neor基因作探针，通过Southern blot鉴定。 6、杂交育种，获得基因剔除的纯合体小鼠
待剔除基因
克隆载体
打靶载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性 连接
HSV-tk
阳性标记基因Neor
内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配
杂合子小鼠
RNA干涉的机制： 在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
转基因小鼠
植入
Southern blot 假孕小鼠
RT-PCR Western blot
后代
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相；
2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基
因组功能；
3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型；
4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的
不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳
传给后代。
一、转基因动物
转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源
基因的动物。 转基因过程： 1、转基因载体的构建； 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； 4、对转基因动物进行鉴定。
启动子
转基因载体
结构基因
报告基因
注射
受精
增强子
全能性细胞
3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶
mRNA的转录。
二、RNA干涉技术
最早是由Andrew Fire 和Craig Mellocai 两人在 1998年2月一次实验中，将双链RNA注射给线虫，发现 其可以引起一种高效、特异的基因抑制效应，他们将这 种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象称为RNA干涉。 RNA干涉技术是指由短的双链RNA诱导的同源 RNA降解的过程，可使基因的表达受到抑制。它是在基 因的转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的方 法。
第七章 基因功能分析的基本策略
基因功能是在细胞组成的多层次的复杂生命体中 实现的，因此对基因功能的研究将极大程度上依赖于
对模式生物的研究。
基因敲除技术、转基因动物模型、基因转染细胞 模型、RNA干涉技术的发展，成为基因功能分析的有 力工具。
第一节 利用转基因模型研究基因的功能
利用动物模型研究未知基因的功能，就是将某 一基因从动物基因组中剔除或将外源基因引入动物
同时G：C比为50%左右③被干涉的靶序列应该是特异 性的，和其它RNA没有同源性。
2、双链干涉RNA的合成；
化学合成法；体外转录法 3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RTPCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
一、反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根
据反义RNA的作用机制可将其分为三类：
1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制
mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。
2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象的变化，从而抑制其翻译。
或生物体内失活的过程。
如果通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动 物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的
动物模型之一。
基因敲除技术的基本过程： 1、打靶载体的构建：一般包括三次DNA体外重组 ①、将待剔除基因作为目的基因克隆到特定克隆载体上；
②、将带有目的基因的重组载体作为克隆载体，利用合
适的内切酶将目的基因片段的大部分切除，使目的基因 活性足以丧失，然后以此线性载体作为克隆载体，将一 个阳性筛选标志基因插入连接到目的基因的中段；例如； Neor基因：使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。
③、在目的基因外侧线性化重组载体，并将一个阴性筛
选标志基因克隆到此。例如：单纯庖疹病毒（HSV）的 胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出
胸苷激酶时，可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类
似物而产生有毒的分解物使细胞死亡。 这样打靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性 筛选标志基因、阴性筛选标志基因。
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶 载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入 在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析
结构基因功能最终是通过其表达的蛋白质来体 现，因此结构基因功能的研究可以在RNA水平上进行，
通过干预蛋白质的翻译过程或减少蛋白质的产量来
分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的 方法主要有两类：一类是反义RNA技术封闭mRNA的功 能；另一类是RNA干涉技术使基因处于沉默状态。
定表达。
稳定转染细胞基本过程：1、真核重组表达质粒的构 建：将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒；2、
在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；3、
将重组表达质粒转染哺乳动物细胞；4、重组质粒转染细 胞的克隆化筛选、保存；5、转染细胞表达目的蛋白、提
取、鉴定。
第二节
基因敲除技术
基因敲除技术是指通过DNA同源重组定向将外源基 因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内
2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常 取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并 保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞
进行筛选。
4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后 将胚泡植入假孕小鼠子宫中；
5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色
dsRNA
形成复合物
Dicer
靶RNA
RNA干涉技术的基本过程 1、确定干涉靶点 选择目标基因是进行RNA干涉的第一步，根据靶基
因序列，确定干涉的具体靶点。
一般作为干涉的靶点序列应具备：①、目标RNA上 被干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点②被干涉的靶序
列一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，
基因组，产生在遗传上经过基因工程修饰（改造）
的动物，实现在整体动物、细胞或分子水平上认识 基因技术概念 转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎 干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机重 组的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA上的 过程。 利用转基因技术可以制备转基因生物或稳定转染细 胞。通常所指的转基因生物是指将外源基因导入受精卵 细胞或胚胎干细胞中，使外源基因通过随机重组插入到 受体细胞的染色体上，并随细胞的分裂而将外源基因遗
待剔除基因
克隆载体
打靶载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性 连接
HSV-tk
阳性标记基因Neor
内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配
杂合子小鼠
RNA干涉的机制： 在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
转基因小鼠
植入
Southern blot 假孕小鼠
RT-PCR Western blot
后代
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相；
2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基
因组功能；
3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型；
4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的
不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳
传给后代。
一、转基因动物
转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源
基因的动物。 转基因过程： 1、转基因载体的构建； 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； 4、对转基因动物进行鉴定。
启动子
转基因载体
结构基因
报告基因
注射
受精
增强子
全能性细胞
3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶
mRNA的转录。
二、RNA干涉技术
最早是由Andrew Fire 和Craig Mellocai 两人在 1998年2月一次实验中，将双链RNA注射给线虫，发现 其可以引起一种高效、特异的基因抑制效应，他们将这 种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象称为RNA干涉。 RNA干涉技术是指由短的双链RNA诱导的同源 RNA降解的过程，可使基因的表达受到抑制。它是在基 因的转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的方 法。
第七章 基因功能分析的基本策略
基因功能是在细胞组成的多层次的复杂生命体中 实现的，因此对基因功能的研究将极大程度上依赖于
对模式生物的研究。
基因敲除技术、转基因动物模型、基因转染细胞 模型、RNA干涉技术的发展，成为基因功能分析的有 力工具。
第一节 利用转基因模型研究基因的功能
利用动物模型研究未知基因的功能，就是将某 一基因从动物基因组中剔除或将外源基因引入动物
同时G：C比为50%左右③被干涉的靶序列应该是特异 性的，和其它RNA没有同源性。
2、双链干涉RNA的合成；
化学合成法；体外转录法 3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RTPCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
一、反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根
据反义RNA的作用机制可将其分为三类：
1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制
mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。
2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象的变化，从而抑制其翻译。
或生物体内失活的过程。
如果通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动 物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的
动物模型之一。
基因敲除技术的基本过程： 1、打靶载体的构建：一般包括三次DNA体外重组 ①、将待剔除基因作为目的基因克隆到特定克隆载体上；
②、将带有目的基因的重组载体作为克隆载体，利用合
适的内切酶将目的基因片段的大部分切除，使目的基因 活性足以丧失，然后以此线性载体作为克隆载体，将一 个阳性筛选标志基因插入连接到目的基因的中段；例如； Neor基因：使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。
③、在目的基因外侧线性化重组载体，并将一个阴性筛
选标志基因克隆到此。例如：单纯庖疹病毒（HSV）的 胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出
胸苷激酶时，可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类
似物而产生有毒的分解物使细胞死亡。 这样打靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性 筛选标志基因、阴性筛选标志基因。
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶 载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入 在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析
结构基因功能最终是通过其表达的蛋白质来体 现，因此结构基因功能的研究可以在RNA水平上进行，
通过干预蛋白质的翻译过程或减少蛋白质的产量来
分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的 方法主要有两类：一类是反义RNA技术封闭mRNA的功 能；另一类是RNA干涉技术使基因处于沉默状态。
定表达。
稳定转染细胞基本过程：1、真核重组表达质粒的构 建：将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒；2、
在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；3、
将重组表达质粒转染哺乳动物细胞；4、重组质粒转染细 胞的克隆化筛选、保存；5、转染细胞表达目的蛋白、提
取、鉴定。
第二节
基因敲除技术
基因敲除技术是指通过DNA同源重组定向将外源基 因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内
2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常 取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并 保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞
进行筛选。
4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后 将胚泡植入假孕小鼠子宫中；
5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色
dsRNA
形成复合物
Dicer
靶RNA
RNA干涉技术的基本过程 1、确定干涉靶点 选择目标基因是进行RNA干涉的第一步，根据靶基
因序列，确定干涉的具体靶点。
一般作为干涉的靶点序列应具备：①、目标RNA上 被干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点②被干涉的靶序
列一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，
基因组，产生在遗传上经过基因工程修饰（改造）
的动物，实现在整体动物、细胞或分子水平上认识 基因技术概念 转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎 干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机重 组的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA上的 过程。 利用转基因技术可以制备转基因生物或稳定转染细 胞。通常所指的转基因生物是指将外源基因导入受精卵 细胞或胚胎干细胞中，使外源基因通过随机重组插入到 受体细胞的染色体上，并随细胞的分裂而将外源基因遗