水质叶绿素a 的测定分光光度法
012 水质叶绿素a比色法分析原始记录
任务编号：分析方法：水质叶绿素a的测定分光光度法 HJ897-2017检出限（方法检出限）：2ug/L
测定波长：664nm；647mn；630nm；750mn比色皿厚度：10mm仪器型号、名称及编号：UV1750紫外分光光度计 THCEMS1-01
序号
样品编号
定容体积(mL)
取样体积(L)
吸
光
度
750nm
664nm
647nm
630nm
测定浓度(ug/L)
备注
精密度检查
序号
与
与
浓度(mg/L)
相对偏差(%)
是否合格
计算公式
ρ＝ρ1V1/Vδ 式中：ρ-水样中叶绿素a的质量浓度，ug/L；ρ1-提取液中叶绿素a的质量浓度，mg/L；ρ1=11.85(A664- A750)-1.54(A647- A750)-0.08（A630- A750）；A664-提取液在664nm波长下的吸光度值；A647-提取液在647nm波长下的吸光度值；A630-提取液在630nm波长下的吸光度值；A750-提取液在750nm波长下的吸光度值；V1-提取液的定容体积；δ-比色皿光程，cm；V-水样体积，L。
注：表中检查合格为“月日校核日期：年月日
叶绿素A的测定
6.离心；将研磨液倒入离心试管中进 行离心，所得上清液倒入10ml的容 量瓶中，再往下层加入2-3ml丙酮， 再离心，将上清液再转入容量瓶中， 接着用丙酮溶液定容至10ml,摇匀。
叶绿素A测定的改良 测定过程中需加强质控。并要平行取样，
平行分析 。 测定叶绿素A时，样品应该尽快测定，
防止过长，叶绿素降解，尽可能在低温 弱光条件下进行。
控制好提取时间，使得提取更充分，保 证较高的提取效率。
这个实验叫做叶绿素A的测定方法探 讨，实验误差较大，最佳的方法还在 不断地深入研究中，有兴趣的同学可 以查阅相关资料，开动大脑马达，提 出自己的见解。
叶绿素A的测定
目录
1
叶绿素A的测定原理
2
叶绿素A的测定方法
3
叶绿素A的测定步骤
4
叶绿素A的测定影响
叶绿素A的测定原理
有机溶剂直接提取浮游生物浓缩样中 的叶绿素，用分光光度计测定其吸光 度，根据叶绿素的特定波长.吸收，用 相关公式计算其含量。
叶绿素主要有叶绿素A和叶绿素B,前 者分子式为C55H72O5N4Mg,叶绿素 B分子式为C55H70O6N4Mg。
2.研磨的损耗；研磨过程中会破坏藻 类细胞的细胞壁，其程度由研磨和转 移而引起的损耗量来决定。人为误差 太大，那么重复操作的精密度就会降 低。
3.酸化的影响；在抽滤浓缩过程中， 叶绿素A分子的酸化造成的叶绿素A的 降解，所以之前在水样中就要加入碳 酸镁浊液（防止酸化）。
4.离心管材料的影响；采用玻璃离心 管，因为丙酮会腐蚀塑料离心管，造 成测定结果偏高，所以采用玻璃离心 管。
感谢您的观看
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2.水样处理；往水样中加入1%碳酸镁 悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。 水样应在低温弱光的环境下保存。
叶绿体色素含量的测定 ----分光光度法
依据下列乙醇提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶 绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
计算公式
95%乙醇提取液中色素浓度的计算
Ca（叶绿素a）=13.95A665 – 6.8A649 Cb（叶绿素b）=24.96A649 – 7.32A665 CT（叶绿素）=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665 Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470 – 2.05Ca-114.8Cb)/248
叶绿体色素含量= 色素浓度（mg.L1） 提取液体积（L） 稀释倍数 样品鲜重（或干重、面积，g或m2）
实验结果
（1）菠菜吸光值
波长（nm） 665 649 470
1 0.249 0.111 0.278
2 0.234 0.104 0.262
3 0.238 0.105 0.268
平均 0.241 0.107 0.269
类胡萝卜素总含量=0.52mg/g
实验结果
（2）全素培养番茄
波长/组别 1
2
3
平均
665nm 0.302 0.306 0.300 0.303
649nm 0.132 0.132 0.131 0.132
470nm 0.359 0.358 0.352 0.356
各色素含量 Ca（叶绿素a）=13.95A665 – 6.8A649=3.33mg/l Cb（叶绿素b）=24.96A649 – 7.32A665 =1.08mg/l CT（叶绿素）=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665=4.41mg/l Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470 – 2.05Ca114.8Cb)/248=0.91mg/l 叶绿素总含量=11.025mg/g 类胡萝卜素总含量=2.275mg/g
叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）
叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得：C A =13.7D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025??A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025??B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025??G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
浅析地表水叶绿素a的测定
浅析地表水叶绿素a的测定地表水中的叶绿素a是表征水体中藻类生长状况和水质状况的一个重要指标。
因此，测定地表水叶绿素a的含量对于了解水体污染状况和富营养化程度具有重要意义。
本文将从叶绿素a的测定原理、样品预处理、测定方法及其优缺点等方面进行分析和总结。
一、测定原理叶绿素作为藻类中的一种重要生物指标，是藻类中光合作用和光能转化过程中的一个必要组分。
因此，其含量的多寡可以直接反映水体中藻类种群大小和生长活力。
测定方法主要基于光学原理，即叶绿素分子在不同波长下有其特征的吸收谱线。
在叶绿素a最大吸收峰处，即为440nm的处所吸收的光强最强。
测定时，通常采用分光光度计在这个波长范围内测量水样的吸光度，再根据比例关系反演出叶绿素a的含量。
二、样品预处理在进行地表水叶绿素a的测定前，需要对样品进行预处理，以保证测量的准确性和可重复性。
常用的处理方法有过滤、沉淀、提取和净化等。
1、过滤将水样通过0.45μm的滤膜过滤，可以去除一些颗粒物、有机碎屑和微生物等干扰源，使其与它物质分离，便于后续处理和测量。
2、沉淀通过让水样在一段时间内自然沉淀或加入沉淀剂（如硫酸镁、三氧化二铁等），可以沉淀掉水体中的悬浮物和植物细胞等，在减少干扰的同时也能提高测量灵敏度。
3、提取提取是在过滤或沉淀的基础上，将藻类生物体内的叶绿素a物质提取出来，常用溶剂有95%乙醇、乙腈和乙醇/二氯甲烷混合溶液等，提取后通过旋转蒸发、干燥或减压浓缩等方式，将提取物转化成可量化的形式。
4、净化有些理化性质相近的物质会干扰叶绿素a的吸收谱线，影响测定结果，因此需要进行净化。
净化方法一般采用高效液相色谱（HPLC）或固相萃取（SPE）等。
三、测定方法及优缺点常用的测定方法主要包括分光光度法、荧光分析法和高效液相色谱法。
以下分别进行简要介绍。
1、分光光度法分光光度法是采用可见光分光光度计测量水体在叶绿素a最大吸收峰处的吸光度，再根据比例关系反演出叶绿素a的含量。
叶绿素a测定
叶绿素a测定
实验三富营养化湖中藻量的测定（叶绿素a法）
一、实验目的
富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类旺盛生长。
此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。
本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度，以考查其富营养化情况。
二、器材与用品
1、分光光度计（波长选择大于750nm，精度为0.5－2nm）。
2、比色杯（1cm；4cm）。
3、台式离心机（3500r/min）
4、离心管（15ml具刻度和塞子）；冰箱
5、匀浆器或小研钵。
6、蔡氏滤器；滤膜（0.45微克，直径47mm）。
7、真空泵（最大压力不超过300kpa）。
8、MgCO3悬液：lg MgCO3细粉悬于100ml蒸馏水中。
9、90％的丙酮溶液：90份丙酮＋10份蒸馏水。
10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各2L.
三、方法和步骤
v ：90％丙酮提取液体积(ml)
V：过滤水样的体积（L）
L：比色杯宽度（cm）
四、实验报告
将测定结果记录于表4－1中
表4－1 测定结果
水样OD750OD663OD645OD630
叶绿素a （微克/升）
A湖水
B湖水
根据测定结果，参照表4－1中指标评价被测水样的富营养化程度。
表4－2 湖泊富营养化的叶绿素a评价标准
类型
指标贫营养型中营养型富营养型叶绿素a（微克/升）＜4 4－10 10－150
五、思考题
1、比较两种水样中的叶绿素a浓度，通过本实验你的结论是什么？
2、如何保证水样叶绿素a浓度测定结果的准确性？主要应注意哪几个方面的问题？。
叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
实验二、叶绿素a和同化系数Q的测定
先用752紫外可见光光度计于750，664， 647，630nm波长测其消光值，按（1）和（4） 式计算Cchl-a和Chl-a浓度。测定时用90％的丙 酮溶液调零。
接着将此提取液用荧光计测其荧光值（Rb）， 按（7）式计算Fd。测定时荧光计若用GFY-160， 则激发波长为360nm、发射波长670nm、负高 压500mV、狭缝0.1、灵敏度档×3。若用 960MC，则参考本实验附录（四）。
（4）
V水样L
式中，Cchl-a 为（1）式的计算结果，V 丙酮为丙酮的体积（mL），V水样为过滤水样 体积（L）。
2、荧光光度法测叶绿素
近年来，海水叶绿素a含量测定的分光光度法已逐 渐被较简便且灵敏度高的萃取荧光法代替。其原理是叶绿 素a的丙酮萃取液受蓝光激发后产生红色荧光，用荧光计 在波长670nm测定提取液酸化前后的荧光值，按下式计 算海水叶绿素a的含量：
CChl-a
Chl-a (mg/m3)
Rb1 Fd1
960MC Rb2 Fd2
1 水 样
2
A
平均
表3 调查水域叶绿素ａ含量和初级生产力源自项目 水样体积样号
(L)
1
水 样
2
平均
GFY160 测定的 Rb1
Chl-a (mg/m3)
PP (mgC/ m3d)
960MC 测定的 Rb2
Chl-a (mg/m3)
２、水样A和B均应作平行样。
实验二、叶绿素a和同化 系数Q的测定
一、目的要求
1、测定水体中的叶绿素a含量和同化系数； 2、掌握初级生产力的测定和计算方法。
二、方法概述
1、分光光度法测叶绿素 浮游植物是海洋最主要的初级生产者，它们
所生产的有机物和贮存的能量是海洋食物链的基 础。因而海洋初级生产力的测定对海洋有机生产 能力以及渔业资源开发利用潜力的估算有着十分 重要的意义。海洋初级生产力的测定有C14示踪 法和叶绿素法。本实验主要介绍叶绿素法，该方 法是根据一定条件下，植物细胞内叶绿素含量和 光合作用产量之间存在一定的相关性，从而根据 叶绿素含量和同化系数（coefficient of assimilation）或称同化指数（assimilation index）来计算初级生产力。
叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）
叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得：C A =13.7D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025??A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025??B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025??G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
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附件3《水质叶绿素a的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明《水质叶绿素a的测定分光光度法》标准编制组二○一五年八月项目名称：水质叶绿素a的测定分光光度法项目统一编号：939承担单位：辽宁省环境监测实验中心编制组主要成员：王秋丽、赵丽娟、王琳、丁振军、刘畅、徐天赐、姜永伟、秦雨、郭杨、朱广钦、叶明、贺业菊标准所技术管理负责人：周羽化、雷晶、张虞标准处项目负责人：张朔目录1项目背景 (1)1.1任务来源 (1)1.2工作过程 (1)2标准制订的必要性分析 (3)2.1叶绿素A的环境危害 (3)2.2相关环保标准和环保工作的需要 (4)3国内外相关分析方法研究 (5)3.1主要国家、地区及国际组织相关分析方法研究 (5)3.2国内相关分析方法研究 (8)4标准制订的基本原则和技术路线 (10)4.1标准制订的基本原则 (10)4.2标准制订的技术路线 (10)5方法研究报告 (12)5.1方法研究的目标 (12)5.2方法原理 (13)5.3试剂和材料 (13)5.4仪器和设备 (16)5.5样品的采集和保存 (17)5.6分析步骤 (21)5.7结果计算 (31)5.8质量保证和质量控制 (34)5.9注意事项 (34)6方法验证 (35)6.1方法验证方案 (35)6.2方法验证过程 (36)7与开题报告的差异说明 (38)8本标准实施的建议 (39)9参考文献 (39)《水质叶绿素a的测定分光光度法》编制说明1项目背景1.1任务来源（1）2006年6月，根据《关于下达2006年度国家环境保护标准制订项目计划的通知》（环办函[2006]371号），原国家环保总局办公厅下达了制订《水质叶绿素a的测定分光光度法》国家环保标准制修订计划，项目统一编号为：939。
（2）《水质叶绿素a的测定分光光度法》项目承担单位为：辽宁省环境监测实验中心。
1.2工作过程1.2.1前期调研工作（1）成立标准编制组2006年7月，辽宁省环境监测中心承接了《水质叶绿素a的测定分光光度法》制修订任务以后，成立了标准编制组。
（2）查询国内外相关标准和文献资料本标准编制组成员根据《国家环境保护标准制修订工作管理办法》（2006年，第41号公告）的相关规定，查阅和收集了国内外相关标准方法和文献资料。
目前国内环境保护部门对于地表水叶绿素测定方面急需建立监测标准方法。
通过对文献的研究，确定了本标准制定的原则、方法和技术依据，确定了本标准应该成为适应我国大部分环境监测及相关实验室仪器设备、技术能力的水质叶绿素测定-分光光度法监测方法标准的目标，并确立研究的相关技术路线。
1.2.2标准开题论证会情况2009年12月8日，“水质叶绿素a的测定分光光度法”承担单位在北京举行了此标准的开题论证会，标准编制小组向论证会提交了本课题的开题论证报告及标准文本初稿。
开题论证会经过论证委员相关质询、讨论，认为标准主编单位提供的材料齐全、内容较完整；对国内外相关标准及文献进行了较为充分的调研；标准技术路线合理可行。
论证委员会通过了该标准的开题论证。
同时提出了具体修改意见和建议：（1）进一步细化操作过程及过程中的质量控制要求；（2）通过方法验证进一步明确叶绿素a的提取方法；（3）鉴于采样、抽滤等环节对测定结果有很大影响，建议具体细化操作过程。
1.2.3标准方法研讨会2014年10月《水质叶绿素a的测定分光光度法》承担单位在北京举行了此标准的研讨会，标准编制小组向论证会提交了本课题的征求意见稿和编制说明。
专家会议意见：（1）编制说明中补充国内外相关标准的主要技术内容和研究方法的最新进展；（2）完善方法验证方案，细化实验条件；（3）重新核实结果单位表述，结果统一用mg/m3表示；（4）确认过滤后样品保存条件；核实计算公式中的校正系数；（5）在标准文本中，明确方法检出限的取样量和比色皿光程等条件；建议改变比色皿光程和增加取样量，以降低方法检出限；（6）完善方法原理的描述；在样品采集中增加现场过滤内容；（7）完善质量保证和质量控制内容。
1.2.4研究并建立标准方法2014年12月～2015年3月，编制组在查询、收集国内外相关标准、文献和技术资料以及专家论证意见的基础上，在标准征求意见稿和编制说明初稿的基础上，细化修改实验条件，对叶绿素测定方法中的技术参数和主要操作过程，如样品保存条件、提取方法（滤膜的选择、研磨、浸泡时间）、质量保证与质量控制等方面做了细致的研究和探讨，并按《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ168-2010）的相关要求修改完善标准方法的有关内容。
2015年4月7日～17日，组织6家实验室进行方法验证。
2015年4月28日，回收验证报告，进行数据的汇总和分析整理。
完成验证报告。
同时对其标准编制说明及标准文本征求意见稿及验证报告进行完善。
1.2.5编写标准征求意见稿和编制说明2014年10月，编写完成《水质叶绿素a的测定分光光度法》的标准征求意见稿和编制说明初稿。
2015年5月，编写完成水质叶绿素a的测定分光光度法》的标准征求意见稿和编制说明的修改。
2015年6月4日，在北京举行了此标准的研讨会，标准编制小组提交了本课题的征求意见稿和编制说明。
专家会议意见如下：1、编制说明中补充国产玻璃纤维滤膜和进口玻璃纤维滤膜性能比较的实验数据；补充不同型号分光光度计比对数据；通过查阅资料，在相关环保标准和环保工作需求上补充我国地表水中叶绿素a的浓度范围；查阅资料和相关实验数据补充叶绿素a计算公式选取的理由。
2、标准文本中，规范性引用文件中，去掉ASTM\SL。
滤膜删除乙酸纤维滤膜。
增加空白实验条款，完善计算公式的表述。
由于方法标准叶绿素a为水质中叶绿素a的含量，计算结果统一用μg/L表示。
2015年6月~8月，按照专家的意见对标准文本及编制说明再次修改完善。
2标准制订的必要性分析2.1叶绿素a的环境危害2.1.1叶绿素a的基本理化性质叶绿素（Chlorophyll）是植物光合作用中的重要光合色素，可分为a、b、c、d四类。
叶绿素不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等；叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解；叶绿素a分子式为C55H72O5N4Mg，酸性条件下，叶绿素a分子很容易失去卟啉环中的镁成为脱镁叶绿素；叶绿素a存在于所有的浮游植物中，大约占有机干重的1%～2%。
2.1.2叶绿素a的环境危害叶绿素a本身对环境没有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指标，可以通过测定水中浮游植物叶绿素a的含量，掌握水体的初级生产力情况和富营养化水平，在环境监测中，叶绿素a含量是评价水体富营养化的指标之一。
水体出现富营养化现象时，由于浮游生物大量繁殖，往往使水体呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等，这种现象在江河湖泊中叫水华。
水体富营养化的危害主要表现在三个方面。
(1)富营养化造成水的透明度降低，阳光难以穿透水层，从而影响水中植物的光合作用和氧气的释放，同时浮游生物的大量繁殖，消耗了水中大量的氧，使水中溶解氧严重不足，而水面植物的光合作用，则可能造成局部溶解氧的过饱和。
溶解氧过饱和以及水中溶解氧少，都对水生动物(主要是鱼类)有害，造成鱼类大量死亡。
(2)富营养化水体底层堆积的有机物质在厌氧条件下分解产生的有害气体，以及一些浮游生物产生的生物毒素也会伤害水生动物。
(2)富营养化水中含有亚硝酸盐和硝酸盐，人畜长期饮用这些物质含量超过一定标准的水，会中毒致病等等。
(3)水体富营养化，常导致水生生态系统紊乱，水生生物种类减少，多样性受到破坏。
中国科学院南京地理与湖泊研究所的秦伯强在《湖泊富营养化及其生态系统响应》中指出，我国是一个多湖泊的国家，其中约三分之一是淡水湖泊，主要分布在长江中下游地区。
这些湖泊中的绝大部分已处于中营养或富营养水平。
湖泊富营养化(Eutrophication)是指水体中氮、磷等植物生长所必需的生命元素大量增加，使得水生态系统的生产力(或者是光合作用速率)增加。
湖泊富营养化是当前我国湖泊面临的主要生态环境问题之一。
湖泊富营养化后会导致一系列的生态系统异常响应。
这些响应包括沉水植物消亡、蓝藻水华频发、微生物的生物量与生产力增加，生物多样性下降，营养盐的循环与利用效率加快等。
整个湖泊生态系统，也会伴随着富营养化的发展，呈现出生物多样性下降、生物群落结构趋于单一、生态系统趋于不稳定的现象。
他在《太湖富营养化与蓝藻水华引起的饮用水危机原因与对策》中指出，我国面积1km2以上的湖泊有2759个，总面积达91019km2，其中只有约1/3的湖泊是淡水湖泊，并且绝大部分是富营养化浅水湖泊，主要分布在长江中下游地区和东部沿海地区，太湖就是这众多浅水富营养化湖泊的典型代表。
蓝藻水华的爆发是一个水体富营养化的主要特征，能够形成蓝藻水华的藻类包括微囊藻等。
但是淡水水体爆发的水华出现过池塘裸藻水华，河流中硅藻水华等。
中国环境科学研究院的许秋瑾等起草的《湖库富营养化防治技术政策》中指出，我国湖泊、水库和江河富营养化的发展趋势非常迅速。
2008~2010年，我国不同区域主要湖泊的TLI 营养状态指数评价结果显示：处于富营养的湖泊数量已占多数，占调查总数的78.7%，其中，处于轻度富营养、中度富营养和重度富营养湖泊数量分别占调查总数的50.7%、21.3%和6.7%；处于中营养的湖泊数量占调查总数的14.6%，且不断向富营养化湖泊转变；处于贫营养状态的湖泊数量只占调查总数的6.7%，主要分布于青藏高原湖区与云贵高原湖区。
我国湖泊富营养化形势已非常严峻。
湖库水环境问题有别于河流，主要是水体富营养化引发的水华问题，例如“三湖”（太湖、巢湖和滇池）。
长期受富营养化和有害蓝藻水华的影响，严重影响饮用水供水安全与生态系统健康。
浮游植物的大量生长是水体富营养化的主要现象，其中叶绿素a是所有浮游植物门类都含有的叶绿素类型．不仅作为水体营养状态划分的重要指标，而且可用于表征浮游植物的现存量．因此，叶绿素a在水体富营养状况评价中起关键性作用。
2.2相关环保标准和环保工作的需要国际上，经济合作与发展组织（OECD）规定了关于评定湖泊营养状态的叶绿素a划分标准，见表1；我国原地表水环境质量标准（GHZB1-1999）中规定了叶绿素a标准值，但是现行有效的地表水环境质量标准（GB3838-2002）没有叶绿素a的标准值。
表1OECD规定的评价湖泊富营养状态的叶绿素a划分标准贫营养中营养富营养重富营养叶绿素a＜3μg/L3～11μg/L11～78μg/L＞78μg/L 此次制订的《水质叶绿素a的测定分光光度法》是《国家环境保护标准“十二五”规划》列出的需制定的标准之一。
《中国淡水藻类-系统、分类及生态（胡鸿钧）》中指出，水体中的藻类植物细胞含有各式各样的色素，但所有的藻类的光合色素系统中都含有叶绿素a，在光合作用中释放出氧气。