五种烟草病毒TMV
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检测步骤
• 1.3 单重wenku.baidu.comT-PCR
单果重RT-P••CR用2P电5CMμR泳-LMb检PuLC测VffeR反结r 标［转准7录5反0酶m应反m体转o系l录/L:合1T4成r．is各-H3病Cμl毒L( pdcHdDH8N．2AO第8，) 一，2．链2050μmLm1o0l×/L 以TMV、CM(，VN2、HμT4LE)dV2N、STOP4(，各02．．15%mTmwoel e/Ln)2，0］1 ，μL2上μL游2和5 下mm游o引l /物L M混g合C物l2 PVY 和TVBM( 各V 150种μm病ol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL 毒的反转录产cD物N作A为模P板C。RPCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性 反应的模板，30经sP，C4R8℃扩退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸 增分别得到大10小m为in2。37取、5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带
病毒混合侵染烟草的检测
• 2007 －2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样 品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟草 脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染.
• 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草 中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。
检测步骤
• 1.4 多重RT-PCR
优C1板∶.M4P化的VV∶后比Y∶1∶的例T∶ET为5•VV1对TB∶∶M引M多 P， 重 时VP1V物V重反R加V∶∶=Y比YT1C1:R转入例.-和．TM5PTV为，录一V-CT4BPT5∶∶MVR合个M种CVB1TVR∶反模成反E=M∶V应反应cVD5应的管N种A体模进，病系板行将毒:，P取RC的将TRT混各M产反合V病物应、病毒随。C株特机M提异混V取、性合总T引作ER物V为N、同多A 1∶ 1∶ 1．• 6。退。火结温果 度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、 显示，退火温度54在℃48和℃和575℃1℃;所延伸时间分别为40、50、60、70、 获得的目的条带80相和对较90好。s;延循伸环次数选择20、25、30、35、40 时间在60 和90和s4能5获个得循理想环的进结行多重RT-PCR体系优化
小结
• 一直以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针 对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等 方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常 关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要 使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要 尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比 对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了 引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致， 保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和 TVBMV 5种病毒
• DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素， 若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本 研究扩增5 个片段大小选择在200 ～ 500 bp 之间。由于多重 RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段 的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同， 因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要 的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和 模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量
果，而且40、50、70 和80 s 之 间没有明显 的差别(
检测步骤
• 1. 6 PCR产物的克隆和测序
多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.＆.Q.凝胶回收试 剂盒回收纯化后，纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4℃ 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM109 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性 和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经 菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委 托金思特科技( 南京) 有限公司测序。
谢 谢!
• 1.3 单重wenku.baidu.comT-PCR
单果重RT-P••CR用2P电5CMμR泳-LMb检PuLC测VffeR反结r 标［转准7录5反0酶m应反m体转o系l录/L:合1T4成r．is各-H3病Cμl毒L( pdcHdDH8N．2AO第8，) 一，2．链2050μmLm1o0l×/L 以TMV、CM(，VN2、HμT4LE)dV2N、STOP4(，各02．．15%mTmwoel e/Ln)2，0］1 ，μL2上μL游2和5 下mm游o引l /物L M混g合C物l2 PVY 和TVBM( 各V 150种μm病ol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL 毒的反转录产cD物N作A为模P板C。RPCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性 反应的模板，30经sP，C4R8℃扩退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸 增分别得到大10小m为in2。37取、5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带
病毒混合侵染烟草的检测
• 2007 －2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样 品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟草 脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染.
• 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草 中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。
检测步骤
• 1.4 多重RT-PCR
优C1板∶.M4P化的VV∶后比Y∶1∶的例T∶ET为5•VV1对TB∶∶M引M多 P， 重 时VP1V物V重反R加V∶∶=Y比YT1C1:R转入例.-和．TM5PTV为，录一V-CT4BPT5∶∶MVR合个M种CVB1TVR∶反模成反E=M∶V应反应cVD5应的管N种A体模进，病系板行将毒:，P取RC的将TRT混各M产反合V病物应、病毒随。C株特机M提异混V取、性合总T引作ER物V为N、同多A 1∶ 1∶ 1．• 6。退。火结温果 度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、 显示，退火温度54在℃48和℃和575℃1℃;所延伸时间分别为40、50、60、70、 获得的目的条带80相和对较90好。s;延循伸环次数选择20、25、30、35、40 时间在60 和90和s4能5获个得循理想环的进结行多重RT-PCR体系优化
小结
• 一直以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针 对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等 方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常 关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要 使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要 尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比 对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了 引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致， 保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和 TVBMV 5种病毒
• DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素， 若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本 研究扩增5 个片段大小选择在200 ～ 500 bp 之间。由于多重 RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段 的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同， 因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要 的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和 模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量
果，而且40、50、70 和80 s 之 间没有明显 的差别(
检测步骤
• 1. 6 PCR产物的克隆和测序
多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.＆.Q.凝胶回收试 剂盒回收纯化后，纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4℃ 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM109 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性 和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经 菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委 托金思特科技( 南京) 有限公司测序。
谢 谢!