仪器分析第4讲 高效液相色谱法

应用范围
热稳定、低沸点的 热不稳定、高沸点、
物质
离子型的物质
热力学理论
较成熟
正在发展中
分析成本
低
高
分离能力 与柱的类型有关
较高
液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph
3.高效液相色谱法的应用
1. 药物分析
约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性 药物的分离分析。
4. 高效液相色谱法的特点
高压 （150×105~350×105 Pa） 高速 （in 1 hr） 高效 （3w/m) 高灵敏度 (UV-ng; FL-10pg; μTAS)
人参、西洋参与三七的鉴别
m AU 200
150
DAD1 C, Sig=203,16 Ref =360,100 (H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE14.D) Rg1
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
一、概述
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色 谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固 定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、 效率高、灵敏度高、操作自动化的特点． 为了更好地了解高效液相色谱法优越性， 现从两方面进行比较：
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法的最大优点在于高速、高效、 高灵敏度、高自动化．
液体的流动相高速通过时，受到的阻力较大， 为了能迅速通过色谱柱，必须对流动相施加 高压15~35 Mpa，因此高压、高速是高效液 相色谱的特点之一。
高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较
粒径(μm) 柱前压力(atm) 分析时间 (h) 色谱柱长度(cm) 柱效(块/m) 样品用量(g)
2. 食品分析
①食品本身组成, 特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白 质、氨基酸、脂肪的分析；
②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜 化学物质的分析；
③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。
3. 制备分离应用
要制备或提取一些高纯化合物，如新合成化合物的结构鉴定，药 物的生物和毒理试验。
液—液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶，两 者的极性差别应很大。
固定液为极性、流动相为非极性的液—液色谱称 为正相色谱，反之，则称为反相色谱。
液液分配色谱法
正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC） ➢ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ✓ 适于分离极性组分
(2)高效 GC 1000塔板/m(填充柱） HPLC 3W 塔板/m
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的， 而高效液相色谱法则经常可在室温条件下 工作．
总之，高效液相色谱法是吸取了气相 色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手 段加以改进，因此得到迅猛的发展．
高效液相色谱与气相色谱的比较
GC
HPLC
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
3-1 高效液相色谱法的特点
1. 高效液相色谱法概述
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性， 为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相 色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克 等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效 液相色谱的时代。
100
80
60
Rewenku.baidu.com
40
20
Rg1
0
10
20
30
Rb1 Rd
40 Rf
Rb1 Rc Rb2
50 Rd
40
50
Rc
40
50
三种药材的HPLC指纹图谱
A
m in
B
m in
C
m in
3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
1. 高效液相色谱中的速率方程
H=A+B/μ+Cμ
高效液相色谱中的速率方程
H
2d p
100 50
R1
Re
0
m AU 35 30 25 20 15 10 5 0
m AU
10
20
30
DAD1 C, Sig=203,16 Ref =360,100 (H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE15.D)
Rg1 Re
10
20
30
DAD1 C, Sig=203,16 Ref =360,100 (H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE16.D)
流动相和固定相都是液体
分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 固定相：载体+固定液 早期物理或机械法涂渍固定液，由于易流
失已较少采用； 现在应用最广的是化学键合固定相：将各
种不同基团通过化学反应键合到担体（硅 胶）表面的游离羟基上。
液—液分配色谱
固定液类型：β, β’ —氧二丙腈、聚乙二醇、角 鲨烷等。
Cd Dm u
(
Cm
d
2 p
Dm
Cs d
2 p
Dm
Cs d
2 f
)u
Ds
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
2. 对速率方程的讨论
选用细颗粒填料可获高柱效（5μm） 流动相流速低，有利于达到高柱效 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 温度的影响(适当提高柱温以降低流动相黏度） 液膜厚度的影响
第三章 高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
希腊语chroma（色彩） graphos（图谱） 俄语Хроматография 德语Chromatographie 英语Chromatography
液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．