脱卤酶的研究及应用

脱卤酶的研究及应用
前言：有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一,主要是由于工业排废以
及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。

在自然界中,大部分异生质卤化物自降解能力很差,同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。

传统的物理方法复杂且容易造成二次污染。

因此，如何应用微生物处理卤代有机物越来越成为研究热点。

1 脱卤酶参与微生物降解的有机卤化途径
从1968年Castro等[1]首次发现以2,3-2二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobateriumsp1)菌株至今,人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物。

微生物不同，它们催化断裂碳卤的机制也不同，如以卤代烷烃脱卤酶和卤酸脱卤酶为代表的水解脱卤，还原脱卤通过还原反应脱卤通过水合作用脱卤。

l，3一二氯-2-丙醇、表卤醇和1，2一二溴乙烷等许多重要的环境污染物的生物降解途径中。

1968年Castro首次在以2，3一二溴丙醇作为惟一碳源而生存的黄杆菌(Flavobaterium sp．)菌株中发现了卤醇脱卤酶，这种菌株可以将2，3一二溴丙醇分解为甘油(图1A)[61。

此后，人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物F-O]。

其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)菌株ADl和节杆菌(Arthrobacter sp．)菌株AD2，以及从土壤中获得的棒状杆菌(Corynebacterium sp．)菌株N一1074等。

研究表明，这几类微生物降解有机卤化物的途径存在明显差异。

例如，在菌株ADl 和AD2的代谢途径中(图lB、D)，都是先生成3一氯一1，2一丙二醇，然后转化成甘油，且都不需要辅因子或氧原子参与脱卤过程。

但对于AD2，前者是个缓慢的化学水解，后一步为卤醇脱卤酶所催化；而对于ADl，由表氯醇到3一氯一1，2一丙二醇快速反应由环氧化物水解酶所催化，相关的基因已被克隆、测序和表达嘲。

从细菌混合培养液中分离得到的革兰阳性菌结核杆菌(Mycobacterium sp．)菌株GPl能够将1，2一二溴乙烷作为其惟一的碳源和能量来源。

在该代谢途径中，1，2一二溴乙烷首先由具水解活性的卤代烷烃脱卤酶DhaAf催化生成2一溴乙醇，然后由卤醇脱卤酶催化为环氧乙烷(图lC)。

在已知的卤醇脱卤酶中，大部分已被克隆、测序、体外重组表达及纯化研究。

通过对数据库中存有的6种不同的卤醇脱卤酶的氨基酸序列进行比对，根据同源性的异同可将这类酶分为3类。

在A组中，来自棒状杆菌N一1074的HheA与来自节杆菌AD2的HheA具有97．1％的序列同源性；B组中来源于分枝杆菌GPl的HheB和来自棒状杆菌N 一1074的HheB有98．4％的相似性；C组来源于放射形土壤杆菌ADl的HheC(以后简称为HheC)和来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的HalB之间有80．7％的相似性。

这3类卤醇脱卤酶具有截然不同的底物范围嘲，如A和B型卤醇脱卤酶对较长链的邻卤醇(C5，C6)具有高的催化活性，而C型酶则适用于催化短链邻卤醇(C2和C3)的转化。

另外，C类对不同的芳香族或脂肪族化合物都具有较高的对映体选择性，而A类和B类却只有适度的手性偏好。

因此，人们对卤醇脱卤酶HheC的稳定性、催化机理、动力学反应机制、三级结构及生物催化特性进行了非常详细的研究。

2 脱卤酶在生物催化方面作用
卤醇脱卤酶的催化特性显示这是一类具有广阔应用前景的多功能生物催化剂。

主要体现在催化邻卤醇与环氧化物之间的转化反应不依赖于辅助因子;卤醇脱卤酶不但可以催化碳2卤键的断裂进行脱卤反应,而且可以高选择性地催化接受
除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂,如N-3、NO-2、CN-等所介导的环氧化物开环反应,用以生成一系列光学纯的β2取代醇[13214]。

尤其在催化CN-介
导的环氧化物开环反应中,不但可以合成一类具有光学纯的高价值中间体
β2羟基腈,而且生成了新的C—C键。

因此,除了已知的转醛酶、转酮酶和羟腈裂解酶外,卤醇脱卤酶也可以作为化学合成中的一种工具酶用于C—C键的合成中。

2.1高选择催化邻卤醇的脱卤反应
卤醇脱卤酶在催化由邻卤醇合成环氧化物方面具有很高的立体选择性,因而通过动力学拆分可以直接合成具有光学活性的环氧化物和卤代醇类。

其中光学纯的邻卤代醇是合成光学纯的环氧化物的前体,
环氧化物环具有极其活跃的反应特性,易于和卤素、碳、氮、氧或硫等亲核试剂反应,因此可以制备很多相关的衍生物。

尤其是具有光学活性的C3环氧化物及其衍生物,如表氯醇、缩水甘油、2,32二氯212丙醇和32氯21,22丙二醇等,由于它们都具有甘油的骨架,因而在手性化合物合成方面极具潜力。

例如缩水甘油衍生物与胺的转化是制备多种β2阻断剂中非常重要的一步[15]。

目前,应用单
加氧酶和环氧化物水解酶来合成光学纯的环氧化物也有相关报道。

来源于放射形土壤杆菌(A1radiobacter)菌株AD1的卤醇脱卤酶HheC可以高选择性地催化不同的芳香族邻卤醇的转化,生成相应的R型环氧化物和S型邻卤醇。

动力学分析显示HheC的高对映体选择性主要取决于酶对不同对映体的绑定和化学反应步骤。

卤醇脱卤酶的这一催化特性也在相关的X射线的晶体学研究中得到了解释[16] 。

三级结构数据显示,对映体(R/S2pNSO)在活性位点的空间结合位置存在着明显的区别。

主要体现在环氧化物环上的氧原子及β碳原子的位置不同。

其中S对映体以非产物形式结合于其上,即环氧化物上的氧原子取向错误,以至于无法与催化氨基酸残基酪氨酸Tyr145形成氢键,亲核试剂无法对β碳原子进行亲核攻击。

因此,只有R构型的对映体才能转化为相应的β取代的醇。

自由能的计算显示二者之间只有很小的差异,这同R构型结合有两个氢键而S构型的结合只有一个氢键相一致。

上述研究结果为该酶的改造奠定了良好的理论基础。

可以应用定点突变技术对酶的底物结合口袋进行改造,来调控HheC的对映体选择性[17]。

通过将该区域的139位酪氨酸突变为较小残基,突变体HheC完全失去了野生态酶对(R) 型对映体的高选择性。

稳态动力学研究表明,这主要是由于突变体对(S)型底物的亲和力大大提高,而对(R)型底物的亲和力有所降低的缘故。

另外,通过对酶催化反应的限速步进行改造可以大大提高酶的催化活化。

突变体HheC如Y187FW249F 在催化对2硝基222溴212苯基乙醇(p2nitro222bromo212phenyl2ethanol)和1,32二氯丙醇的转化过程中其活性得以提高。

主要是因为增加了卤离子的释放度,该步骤为这些底物转化的限速步骤[18]。

这些研究表明定点突变在调控卤醇脱卤酶的活性与对映体选择性方面是一种值得推广的好方法。

卤醇脱卤酶在选择性催化邻卤醇转化为环氧化物反应中,由于反应热动力学平衡的存在,使得反应难以完全进行。

闭环反应是否完全进行主要取决于底物中卤素取代的类型。

对于氯取代的邻卤醇,平衡更倾向于形成卤醇,并遵循以下顺序Cl->Br->I-。

为了避免由此而造成较低的对映体过剩值(e1e1),Lutje等[19]通过加入过量的环氧化物水解酶来提高产物的光学纯度,并获得光学纯S型2,32二氯212丙醇和22氯21,32苯基乙醇(e1e1值均于99%),且E值分别为>100和73。

2.2亲核试剂介导的环氧化物开环反应
卤醇脱卤酶的多功能性主要体现在亲核试剂所介导的环氧化物开环反应中。

Lutje等[14]以对硝基苯乙烯氧化物为底物的反应中测验了卤醇脱卤酶与
一系列的离子和非离子亲核试剂参与反应的能力,发现酶可以接受Br-、Cl-
、N3-、NO-2和CN-等阴离子作为亲核试剂,并且具有较高的区域与对映体选择性。

新近研究表明,除了上述亲核试剂,卤醇脱卤酶还可以接受其余4种阴离子亲核试剂,I-、SCN、OCN-和HCOO-[20221]。

在环氧化物开环反应中,卤醇脱卤酶可以高选择性地催化9种不同的亲核试剂所介导的反应。

因此,可以通过动力学拆分手段制备多种具有光学纯的β2取代醇和环氧化物,充分显示出卤醇脱卤酶的广阔应用前景。

2.2.1环氧化物的叠氮化最早生物法催化环氧化物叠氮化反应是由红球菌Rhodococcussp.的酶粗提液参与完成的[22],其终产物叠氮化醇具有很低e1e1值,并且人们对粗提液中真正起催化作用的酶了解甚少。

此外,可以接受N-3作为亲核试剂的生物酶种类也很少。

卤醇脱卤酶可以接受N-3作为亲核试剂,而且反应表现出极高的立体选择性[13]。

如HheC在催化对2硝基氧化苯乙烯
(p2nitro2styreneoxide,pNSO)进行叠氮化反应,其终产物(R)212对2硝基苯基222叠氮化乙醇的e1e1值为96%,同时没有反应的(S)型环氧化物的e1e1值高于99%。

除了对2硝基氧化苯乙烯外,HheC对对2氯环氧苯乙烯也显示出极高的立体选择性(E>200)。

对氧化苯乙烯的选择性却一般,主要是由于后者化学性环氧化物叠氮化反应很快。

通常,化学性环氧化物叠氮化反应是α位的区域选择,而酶催化的反应显示出了很高的β区域选择性。

因此,化学性环氧化物叠氮化反应的存在,在某种程度上降低了该反应的立体选择性。

上述动力学拆分的最大不足之处是其最高产量只能达到50%,而动态动力学拆分则利用了非偏好对映体可以发生外消旋反应这一特性,可以使最终产量高达100%Lutje等[23]正是利用这一特性以表溴醇为底物对其叠氮化反应进行了研究。

反应体系中加入一定浓度的溴离子,表溴醇除了可以发生叠氮化反应外还可以生成1,32二溴丙醇。

由于HheC对1,32二溴丙醇闭环反应具有较低的对映体选择性,而对表溴醇的叠氮化反应具有很高的对应体选择性,因此,表溴醇可以通过该反应进行外消旋化。

在一定条件下,以表溴醇为底物,通过动态动力学拆分可以使得e1e1值大于99%的(S)212叠氮基232溴222丙醇的产量提高到77%。

总之,环氧化物的叠氮化开环反应可以用于合成具光学活性的叠氮醇该产物是极具应用价值的生物活性物质———胺醇的直接前体。

2.2.2环氧化物的亚硝酸化HheC催化的以NO-2作为亲核试剂的环氧化物开环反应较上述的叠氮化反应复杂,主要是由于NO-2的兼性离子特性,即氧原子和氮原子都可以对环氧化物环上的C原子进行亲核攻击。

虽然NO-2介导的环氧化物开环反应同叠氮化反应一样具有较高的区域选择性(β位进攻为主),仍然可以产生两种取决于亲核试剂的N/O选择性攻击而得到的异构体产物。

其中产物之一亚硝酸酯在水溶液中尤其在低pH值情况下极不稳定,很容易水解成相应的二醇,它由亚硝酸根上氧原子攻击环氧化物环上β碳原子所得;当氮原子攻击环氧化物环上β碳原子时,产物为硝基醇(图2)。

研究结果显示,野生态HheC在催化环氧化物亚硝酸化反应中,以氧原子攻击环氧化物环上β碳为主,因此终产物大部分是二醇[24]。

同叠氮化反应一样,卤醇脱卤酶在催化环氧化物的亚硝酸化反应中仍然显示出对(R)型环氧化物的立体偏好性。

其对映体选择性的高低主要取决于环氧化物的结构,当环氧化物为芳香族或具有α,α2双取代的环氧化物时,
卤醇脱卤酶显示出极高的对映体选择性;当底物为一般的端位脂肪族环氧化物时,卤醇脱卤酶通常具有较低的对映体选择性。

此外,当以pNSO为反应底物时,通过动力学拆分不但可以得到对2硝基苯基21,22乙二醇(e1e1=91%),而且得到具有99%e1e1值的(S)2环氧化物,其产量为48%。

因此,从某种意义上讲,卤醇脱卤酶可以替代环氧化物水解酶进行环氧化物的制备。

2.2.3其他亲核试剂所介导的环氧化物开环反应卤醇脱卤酶也可以接受硫氰酸根作为亲核试剂[20]。

在有硫氰酸根和环氧丁烷存在的条件下,酶促反应的产物中只含有(R)212异硫氰酸222丁醇。

这表明作为兼性离子的SCN-,只发生硫原子对环氧化物环上的β碳原子的亲核攻击,且反应具有很高的对映体选择性。

此外,甲酸根也是卤醇脱卤酶的底物,但与前面几种亲核试剂不同之处是甲酸根进行亲核攻击的位点是环氧化物环上的α碳原子,而不是β碳原子。

展望：虽然现在对脱卤酶结构与功能已经有了很大的研究，但对于如何解决产
物对酶活性的抑制，如何应用相关的蛋白质工程技术提高酶对映体的选择性还不能明确阐明。

如果解决这些问题将会大大加速脱卤酶产业化进程。

尽管现在对脱卤酶的研究仍处于初始阶段，但由于它的催化作用及在绿色化学中重要地位，它将会变得越来越重要。

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