多肽和KLH偶联(1)

MBS/BDB/SMCC/sulfo-SMCC
1、SMCC
琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯
分子一端的NHS酯基团与某一蛋白质分子的伯氨反应形成稳定的酰胺键，另一端(马来酰亚胺基团一端)可与另一蛋白质分子的巯基交联。

NHS活性酯与伯胺在PH7-9的环境形成酰胺键。

马来酰亚胺与巯基在PH6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。

在水溶液中，NHS 活性酯的水解是（与氨基的反应）个竞争反应。

马来酰亚胺比NHS稳定，但是在PH大于7.5时，马来酰亚胺会慢慢水解，失去与巯基反应的特异性。

因而，在使用SMCC时通常是在PH7.2-7.5的环境下进行，并且先让NHS发生反应。

SMCC结构里的环己烷环可以降低马来酰亚胺的水解速率。

这使得蛋白质在用SMCC修饰之后可以冻干存放一段时间。

很多蛋白质都选用该试剂来进行马来酰亚胺修饰。

用SMCC来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋白质，经常采用两步合成法。

首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应完的SMCC。

然后，再与含有巯基的蛋白质反应。

在实际操作中要注意的是，SMCC怕潮湿，存放时要和干燥剂一起存放。

并且使用中从冰箱拿出来时要先在室外放置一段时间平衡温度，以免立刻开启，空气中水分遇冷凝结，破坏SMCC 结构。

1、将20 mg SMCC（这是联接40条多肽的量）溶于2 ml DMF。

2、将0.8 ml KLH加入到25 ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使蛋白终浓度为15
mg/ml。

3、将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120 mg KLH 蛋白体系中，室温搅拌反应1h。

4、用1 L 1×PBS (PH 7.4) 溶液于4℃下透析6 小时，除去游离的SMCC。

5、将透析后的KLH蛋白倒入50 ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根
据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5 mg KLH-SMCC溶液转移到5 ml离心管中。

例如：反应前加
2、入KLH蛋白的量为120 mg，透析后的KLH蛋白体积为20 ml，那么透析后的KLH
蛋白浓μl KLH-SMCC溶液转移到5 ml离心管中。

6、将3.0 mg 多肽用0.6 ml 1×PBS (pH 7.2) 溶液溶解。

注意：这里多称量出0.5 mg多肽是用来做ELISA检测的，取出100 μl即可。

检测多肽随交联好的抗原一起寄出，浓度为5 mg/ml。

7、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100 μl Ellman试剂储备液，
再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412 nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。

Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。

8、将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。

9、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100 μl Ellman试剂储备液，再加入10 μl 教练后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412 nm下测定紫外吸收值。

OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80%以上；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。

如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH 蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。