凝胶排阻

测量法 1.床体积与Vo，Vi，Vg之间的关系式是： Vt=Vo+Vi+Vg (1-1) 2.洗脱体积与Vo，Vi的关系式为： Ve=Vo+KdVi (1-2) 式中Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配 系数，也可以视为相对分子质量不同的溶质在凝胶 颗粒的内部和外部的分配系数。它只与被分离物质 相对分子质量的大小、凝胶颗粒空隙和网状孔径大 小有关，与层析柱的长短和粗细无关。Kd可以通过 实验获得。
凝胶层析Fra Baidu bibliotek分离范围示意图
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二、参数的表示方法及其意义
1.柱床体积 凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体 积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积 或床体积，以Vt(total volume)表示，单位为ml。 2.外水体积 存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒 之间的空隙所占有的那一部分水相体积或溶剂体积， 称之为外水体积或外体积，以Vo(outer volume)表 示，单位为m1。
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样品中分子量大小不同的各种分子在流过 凝胶内部网状孔时就受到凝胶介质排阻效应， 也称为分子筛效应，将它们一个一个分离， 从而达到分离的目的。普通筛分是大颗粒不 能通过筛子的筛孔而被截留在筛板的上面， 小颗粒可以通过筛孔。所以普通筛分与凝胶 层析筛分的原理是不一样的。排阻层析分离 的基本原理如图所示。
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第二节 凝胶层析原理
一、基本原理
凝胶类层析介质是一种在球体内部具有大 孔网状结构凝胶微粒，不同大小的网状孔径像 筛子一样，可以把大小不同的生物大分子按一 定的顺序进行分离，好像“目数”不同的普通 筛子一样把大小不同颗粒分级筛分。但是排阻 层析与普通筛分的原理不同，排阻层析是按生 物分子分子量的大小排序进行筛分的。
以上关系可以通过图2表示。
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四、Kd的几种判断
在凝胶柱层析过程中，Kd可以有以 下几种情况： 1.Kd=0时，Ve=Vo 对于完全不能进入凝胶 内部的大分子(全排阻)，其洗脱体积就 等于外水体积。 2.Kd=1时，Ve=Vo+Vi。对于完全可以进入 凝胶内部的小分子(全渗透)，其洗脱体 积就等于外水体积和内水体积之和。
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3.内水体积 是凝胶吸水溶胀后，存在于凝 胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶 剂体积，称之为内水体积或内体积以 Vi(inner volume)表示，单位为m1。 4.凝胶体积 是凝胶颗粒自身的体积，也就 是床体积减去外水体积和内水体积后所占 有的体积，称为胶体积或称干胶体积,以 Vg(gel volume)表示，单位为m1。
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相对分子质量大的生物分子由于不能进入 或不能完全进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶 颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对 于小分子迁移的路径近，在柱内的停留时间短， 保留值小，所以在层析过程中迁移率最快，走 在小分子的前面，先从柱中流出；
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分子量小的分子由于能够进入凝胶内部 的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状孔 流过，相对于大分子迁移的路径长，在柱内 的停留时间长，保留值大，所以在层析过程 中迁移率最慢，走在大分子的后面，后从柱 中流出。
第一节
概述
排阻层析(exclusion chromatography)，亦称分子筛层析 (molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gelfiltration)。 凡是利用生物大分子的相对分子质量(relativemolecular mass， Mr)差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于排阻层析 的分离介质称为排阻层析介质。在20世纪60年代初就开始使用凝 胶介质分离生物大分子。例如，用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持 物分离血清中的蛋白质，凝胶在其中起分子筛作用。后来人们将 凝胶制成球形微珠，作为液相层析分离介质，用于分离生物大分 子，并获得巨大成功。现在使用的凝胶层析介质的用途远远超出 了电泳分离介质的范畴，已成为分离纯化生物大分子最重要的分 离介质之一，也是作为合成带有配基的层析介质应用最广泛的一 种载体。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等 为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、 分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。
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凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。 第一部分是全排阻分子，也可称之为上限分子 量，不能起筛分作用的大分子。第二部分是部 分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效 分离的分子。第三部分是全渗透分子，称之为 下限分子量，是不能起筛分作用的小分子。
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从图可以看出，A-B之间为该凝胶的有效分 离范围，可分离相对分子质量范围是1000～ 100000，高于相对分子质量为100000的是全排 阻分子，低于相对分子质量为1000的是全渗透 分子。
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由此可见，对于某一凝胶介质，如果在 层析过程中有两种全排阻的大分子，即Kd=0， 尽管它们在分子量之间的差别很大，但由于 它们已经超出了该凝胶质的所能分离大分子 的范畴，不可能有分离效果。
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同样两种小分子全部都能进入凝胶颗 粒内部空隙， Kd=1，尽管它们在分子量大 小仍有差异，但由于它们已经超出了该凝胶 质的所能分离小分子的范畴，同样也不可能 有分离效果。因此，不同型号的凝胶介质有 不同的相对分子质量分离范畴。在进行排阻 层析之前，根据分离的相对分子质量选择合 适的凝胶介质。
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3.Kd与体积之间的关系 可以将式(1-2)变换一下， 即可得到Kd与体积之间的关系式：(1-3)
Ve – Vo
Kd= Vi
式中 Ve-实验测得的实际洗脱体积。
可用不被凝胶滞留的大的相对分子质量组分 测得，通常用相对分子质量在2×106的蓝色葡聚糖 -2000测定，可以通过干胶的吸水量(每克干胶所 吸附水的毫升数)求得。对于一定条件的凝胶层析 柱来说，只要通过实验得知某一组分的洗脱体积Ve， 就可以计算出Kd值。
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5.洗脱体积 自加样液时开始，到洗脱组分 浓度最大时出现的峰(洗脱峰峰顶)为止，所 收集的体积，以Ve(elution volume)表示， 单位为m1 计算法：根据层析柱体积计算总体积可用下列公

式表示

Ｖt=πr2h
干凝胶用量（克）＝ πr2h ／膨胀度（床体积／克干胶）
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三、参数之间的关系