细胞培养技术考题

1.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。

激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞核血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。

（在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

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2.谷氨酰胺在细胞培养中起什么作用及使用方法？作用：几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。

使用方法：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。

配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

3.如何用台盼兰计数活细胞？正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。

台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。

（用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。

轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。

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4.如何消除组织培养的污染？确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

（一）认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌。

（二）改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌。

（三）操作人员严格遵守无菌操作规程。

（四）培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量。

（五）在培养基中加入适量的抗生素。

（六）利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗。

（七）利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长。

（八）减少培养基中的某些有机成分，可抑制微生物的生长繁殖。

5.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

6.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

由–20℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

7.二价离子会抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？二价离子能够抑制胰蛋白酶活性。

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。

在胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

8. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？液体培养基冷冻后再经融化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往会变碱，某些成分溶解也会受到影响，对细胞生长不利，故培养液一定要存放在冷藏条件下。

9.培养用液pH对细胞生长的影响？由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长产生有害的影响。

但各种细胞对pH的要求不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受能力强。

但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。

10.MTT法的原理？又称细胞增殖检测活细胞线粒体中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。

二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。

用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定甲臢染料的吸光值，可间接的反应活细胞数量。

细胞培养实验室的基本设备有哪些常用的基本设备：1、仪器：显微镜、培养箱、干燥箱、水纯化
装置、冰箱或冷藏箱、细胞冷冻储存器、离心机、天平、消毒器、滤器；2、基培养用器皿：培养瓶、培养皿、多孔培养板；3、培养操作有关器皿：贮液瓶、吸管、加样器等；4、用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。

特殊设备：酶联免疫检测仪，超低温冰箱，旋转培养器，荧光显微镜，流式细胞仪及其他用于检测细胞培养条件的各种仪器。

（【实验设备】：无菌操作室(包括更衣间，缓冲间和操作间）准备室的设备：三蒸水器，酸缸，烘箱，高压锅，储品柜（放置未消毒物品），储品规（放置消毒过的物品），包装台。

配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品），PH计（测量培养用液PH值），磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液），滤器及泵。

培养室的设备：液氮罐，储品柜（存放杂物），日光灯和紫外灯，空气净化器系统，低温冰箱（-80℃），空调，二氧化碳缸瓶，边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞），超净工作台，倒置显微镜，CO2孵箱（孵育培养物），水浴锅，4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

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1.培养器皿的清洗与消毒
玻璃器皿的清洗
一般经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后50℃烘干。

新的橡胶制品洗涤方法
0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，
0.5M HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，
蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

压力蒸汽消毒器：湿热消毒，15磅，维持20-30分钟。

消毒前常用的包装材料：牛皮纸、棉布、铝饭盒
*
电热干燥箱：干热消毒，160℃～180℃，维
持2小时。

主要用于玻璃器皿消毒。

3.培养用液有哪些水、平衡盐溶液（PBS、D-Hank,s液）、碳酸氢钠液、HEPES缓冲液、胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液、抗生素溶液、天然培养基（血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液））和合成培养基（包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物；目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM）
4.如何进行细胞计数，注意什么，细胞计数法：就是从需要计数的细胞悬液中取出一定量细胞进行计数，并通过计数得知原始细胞悬液中的细胞密度以及细胞总和数。

在细胞计数时，若细胞浓度太高，可进行必要的稀释。

血球计数板每一大方格长为1mm ，宽为1mm ，高为0.1mm ，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl ，那么每ml 溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的1000 0 倍。

实验步骤（一）准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干。

（二）制备细胞悬液：用胰蛋白酶消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。

要求细胞密度不低于104 /ml ，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm ，2min ），重悬浮于少量培养液中。

（三）加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。

用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样。

（四）计数：在显微镜下，用10 ×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

（五）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数/ 毫升原液= （4 大格细胞数之和/4 ）×104×稀释倍数）注意事项（一）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液，否则会影响细胞计数结果。

（二）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。

在连续取样计数时，特别应该注意这一点，否则前后计数结果会有很大误差。

（三）镜下计数时，遇到2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。

如细胞团占10% 以上，说明消化不充分；或细胞数少于200 个/10mm2或多于500 个/10mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。

5.台盼蓝细胞染色步骤1、4%台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水100ml，用滤纸过滤，4度保存，使用时用PBS稀释至0.4%（也可以买Gibco的成品）；2、胰酶消化贴壁细胞，制作单细胞悬液，并作适当稀释；3、染色：细胞悬液与0.4%的台盼蓝溶液以9:1混合均匀（终浓度0.04%）；4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞；5、镜下观察：死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状；6、统计细胞活力：活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100%。

6.MTT比色法实验步骤普通MTT法实验步骤：1.接种细胞：用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个接种于96孔板，每孔体积200ul。

2.培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可以根据实验目的和要求决定培养条件）。

3.呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml 用PBS配成，pH=
7.4）20ul继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO,脱色摇床振荡10min，使结晶物充分溶解。

4.比色：选择570nm（490nm）波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

7.细胞冷冻与复苏方法细胞冷冻方法：1.消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。

2.1000rpm离心10min，弃上清液。

3.沉淀，加含保护液的培养液，计数。

4.将细胞悬液分装至冻存管中，每管1m l。

5.将冻存管封严。

6.贴上标签，写上细胞种类，冻存日期。

7.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

8.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。

9.置于-80超低温冰箱中放置过夜。

10.置于液氮罐中长期保存。

11.同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

细胞复苏方法：1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃-38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

（细胞复苏方法实验前准备： 1.将水浴锅预热至37℃。

2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

取出冻存管：1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

迅速解冻：1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min 。

制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。

2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。

培养细胞：将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37℃。

2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

）
免疫组化的定义、实验步骤、分析、需要的试剂。

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

原理：抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。

先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。

由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

实验步骤（1）使用多聚赖氨酸防脱载玻片贴4μm石蜡切片。

（2）58℃烤片4小时。

（3）切片脱蜡至水。

（4）蛋白酶消化或抗原热修复（此步视一抗及组织具体情况而定）。

（5）PBS洗3min×3次。

（6）组织切片于室温下置于3% H2O2水溶液中15-20min以阻断内源性过氧化物酶。

（7）PBS洗3mi
n×3次。

（8）滴加非免疫动物血清，室温孵育20min，封闭抗体非特异性结合位点。

（9）甩去非免疫动物血清，直接滴加适当稀释的特异性一抗， 37℃孵育90-120min。

（10）PBS洗3min×3次。

（1 1）滴加二抗（二抗操作步骤视选用的免疫酶组织化学方法而定）（12）PBS洗5min×3次。

（13）D AB或AEC显色3-10min，显微镜下监控显色程度，水洗。

（14）苏木精复染，水洗。

（15）1%盐酸酒精分化数秒，水洗。

（16）饱和碳酸锂水溶液返蓝，水洗。

（17）梯度酒精脱水，透明，封片
2.如何修复抗原高压修复：1.pH=6.0柠檬酸盐缓冲液。

2.大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。

3.盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后。

胰酶消化修复：1.于试管中加入一滴的胰酶浓缩剂和三滴稀释剂（1：3），均匀混合。

2.在组织切片上滴加100μl（两滴）混匀的酶试剂。

3.37℃孵育15-20分钟。

3.ABC、SP、SABC法的原理与注意事项ABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。

利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。

但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。

SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。

PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。

最大的优点是不受种属的特异性限制。

此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。

SABC法：链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。

链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000。

同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。

亲和素的等电点为IP10.0-10.5,在一般缓冲液中带阳电荷，对组织和细胞的阴离子集团有较强的亲和力，因而基于亲和素的免疫组化方法有时会有严重的背景问题。

而链霉亲和素等电点接近中
性,IP=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低，因而基于链霉亲和素的免疫组化方法背景往往很低。

SABC 即StreptAvidin—Biotin Complex,。

根据研究，SABC 大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。

先用用生物素标记的二抗特异性的结合一抗，然后通过二抗募集大量的链酶亲和素—过氧化物酶复合物，形成链霉亲和素复合体（SABC）。

大量的酶将保证SABC 具有很高的敏感性。

SABC 兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。

两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC复合物即链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。

4.PCR反应原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

•这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

又称体外DNA 扩增技术。

是指利用耐热DNA 聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA 片段的一种技术。

它能快速将皮克(pg)水平的DNA 特异地扩增100万倍左右，达到微克(μg)水平。

7.PCR 反应的体系是什么，用量是多少
反应体系：模板、引物、Taq DNA 聚合酶、dNTP 、Mg2+、缓冲液、反应温度、循环次数、PCR 仪等 50μl PCR 反应体系中模板DNA 推荐使用量
引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异
性；同时尽可能减少非特异性扩增 1）引物长度要合适，一般为16～30个核苷酸，常用20bp 左右。

2）G+C 含量一般占50％～60％，有利于引物与模板的结合。

G C 太少扩增效果不佳，G C 过多易出现非特异条带。

3）ATCG 4种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。

否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。

4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。

5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。

6）引物与非特异性序列的同源性不能超过70%或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特异性扩增。

7）引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引物3’端最佳碱基选择是G 和C 。

8）引物的5’端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等。

9）引物扩增跨度：以200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。

9.退火温度是如何选择的
合适的退火温度比引物本身的Tm 低 5 ℃，一般在 55 ℃ 左右。

<小于20bp 片段>Tm 值(解链温度)= 4(G+C)＋2(A+T ）
10.反应温度的设定
11.PCR 的注意事项及常出现的问题（参见聚合酶链反应P48）
注意事项：一、由于PCR 的灵敏性极高，故微量的样品污染便可导致假阳性结果的出现。

所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染
采取的措施：1）隔离不同的操作区。

2）采用一次性用具。

3）严格按无菌操作原则进行。

4）并设置严格的对照，以提高PCR 结果的正确性。

二、除实验样品外，应设几种实验对照：1）阳性对照：阳性DNA 模板参与的PCR 反应；阳性对照要人基因组DNA 0.1-1 μg 大肠杆菌基因组DNA 10-100 ng λDNA 0.5-5 ng 质粒DNA 0.1-10 ng
选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本。

2）阴性对照：无核酸模板参与的PCR反应；在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。

1.Western Blot 原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

（Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

）
2.常见问题分析（参见Western blot P33-35）。