Silica bead gel extraction-说明书

注意事项：
1、需要对浓缩的漂洗缓冲液进行稀释：
Concentrated Washing Buffer: 15 ml
Distilled water: 285 ml
Ethanol (95-100%): 300 ml
Total Volume: 600 ml
2、TBE可能抑制DNA在硅胶珠上的连接。

TBE转化缓冲液能够中和TBE缓冲液的抑制作用，因此，从TBE琼脂糖凝胶中纯化DNA片段时应该使用。

3、干燥不会对硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）造成损坏。

如果长期储存过程中，悬浮液变干，则向管中加入去离子水，使固体和液体的数量相当，重新可用。

4、如果试剂盒不经常使用，或者多人共用一个试剂盒，将硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）中的硅胶分装到几个小管，并储存于-20度。

保存：
Silica Bead DNA Gel Extraction Kit使用前应保存于4度。

稀释后的漂洗缓冲液应保存于-20度。

如果不经常使用，硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）应该分装，暂不使用的小管应该储存于-20度。

纯化步骤
注意：所有纯化步骤在常温下进行；离心速率>12000×g。

A:从凝胶中纯化DNA
第一步：切胶；称重；（尽量避免紫外照射）；
第二步：按照3:1的体积比，向胶溶液中加入连接缓冲液（Binding Buffer）。

55度加热5min 直至凝胶完全溶解；溶解过程中每隔几分钟翻转混合；
检查溶液颜色，黄色表明达到DNA连接的最优pH值。

如果颜色变成橙色或紫色，加入10uL 3M乙酸钠(pH=5.2)，混匀。

此时溶液颜色变成黄色。

注意：如果从TBE琼脂糖凝胶中回收DNA，加入1/2体积的TBE转化缓冲液，和4.5倍体积的连接缓冲液。

第三步：将重悬的硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）加入到DNA/连接缓冲液中。

对于<=2.5ug的DNA，加入5uL硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）。

对于>2.5ug的DNA，每ug DNA加入5uL硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）。

混合液于55度加热5min，使DNA连接到硅胶基质上。

每隔几分钟震荡混合，使硅胶粉末悬浮。

注意：如果纯化大量ＤＮＡ，或者连接反应体积高于１．５ｍｌ，将加热时间延长至１５ｍｉｎ。

第四步：硅胶粉末／ＤＮＡ混合液，旋转５ｓ形成沉淀。

小心去除上清溶液。

（可选步骤）沉淀后的硅胶粉末／ＤＮＡ混合物另用３００ｕＬ连接缓冲液重悬，以溶解第２步中任何残留的未溶解琼脂糖。

将悬浮液放在５５度水浴锅中几分钟，进行第５步。

第五步：加入５００ｕＬ冰浴的洗脱缓冲液（用乙醇稀释），重悬沉淀，旋转５ｓ。

去掉上清液。

重复此步骤３次。

最后一次洗涤的上清液去掉之后，再次旋转小管，并用枪头吸走残留的液体。

如果必要，空气风干沉淀物１０－１５ｍｉｎ，避免纯化的ＤＮＡ溶液中出现残留乙醇。

ＤＮＡ中的残留乙醇可能会抑制下游反应。

注意：
为了得到有效的漂洗，沉淀物应该充分重悬。

可以用振荡器，吹吸，或用吸头手动搅拌重悬。

对于＞＝５ｋｂ的ＤＮＡ片段，翻转小管，重悬沉淀。

震荡可能会导致大ＤＮＡ片段被剪断。

第六步：用所需体积的灭菌去离子水或ＴＥ缓冲液重悬沉淀，并在５５度下加热５ｍｉｎ。

旋转小管，取出上清液，置于新管中，重复提取一次，合并上清液。

为了去除参与的硅胶粉末，再次旋转小管３０ｓ，转移上清液至新管。

注意：最优洗脱体积和第三步中加入硅胶粉末悬浮液（silica powder suspension）的体积相等。

Ｂ从反应液中纯化ＤＮＡ
可能的问题：
１、低ＤＮＡ产量：
凝胶溶解不完全：大量凝胶或凝胶浓度大于２％，需要延长溶解时间。

另外，凝胶溶液的振荡有利于溶解；
ＤＮＡ连接效率低：加入的硅胶粉末悬浮液数量要正确；如果大量ＤＮＡ或反应液体积超过１．５ｍｌ，则延长水浴时间至额外的１５ｍｉｎ；如果从ＴＢＥ凝胶中提取ＤＮＡ，加入１／２体积的ＴＢＥ转化缓冲液，对于给定体积的凝胶，加入４．５倍连接缓冲液；对于非ＴＢＥ凝胶中得ＤＮＡ，加入１／１０体积的ＴＢＥ转化缓冲液；
漂洗不正确：首先保证稀释了浓缩漂洗缓冲液。

乙醇体积很重要，终浓度要大于５０％。

请勿真空干燥沉淀物，如果需要，空气中风干１０－１５ｍｉｎ。

洗脱不充分：洗脱的水或ＴＥ缓冲液体积不够。

重复洗脱步骤２－３次。

２、下游实验失败
洗脱液中有乙醇残留；每次漂洗之后，保证残留漂洗液被去除，最后一次漂洗之后，旋转小管，去掉残留液体。

空气风干沉淀物１０－１５ｍｉｎ。

洗脱液中有残留的硅胶珠：回收洗脱上清液时，请勿扰动沉淀；如果必要，对于洗脱的ＤＮＡ溶液，再次离心，将上清液转移到新的离心管。

洗脱液中有过量的盐：保证漂洗步骤有效；在每个漂洗过程中，沉淀应该完全悬浮；用漂洗缓冲液对沉淀进行３次漂洗。