细胞的克隆培养及筛选ppt课件

(b). 克隆筛选：单个集落的分离(见后面“克隆的分离”)。
如果没有可见集落，则更换培养基后再培养一个星期，如果 有必要还可以更换培养基后培养三个星期，如果再没集落出 现，则不再有可能出现集落。
单层贴壁细胞 的克隆培养
克隆形成后，可以直接从 多孔板分离培养 可以用克隆培养环技术培 养，或者遮蔽一个集落， 再用射线照射培养瓶
4. 细胞计数，将细胞悬液稀释至接种需要的浓度。如果是第
一次克隆培养，选择每毫升中10、50、100和200个细胞 进行实验。
操作步骤
5. 将需要量的细胞种入培养皿中。 6. 在CO2培养箱中保温培养，静置培养一周，如果 有集落 形成，则进行以下处理： (a). 贴壁形成率分析：集落的染色和计数。
克隆培养
克隆培养也可作为对细胞的存活能力的检测，可用于选择细 胞的最适生长条件（培养基和血清的选择）和测定细胞的化 学及放射敏感性;
单层贴壁细胞的克隆培养可用培养皿、多孔板或培养瓶进行。 由于细胞持续贴壁，比较容易识别单个细胞所形成的集落， 显微操作是唯一公认的决定性方法; 悬浮细胞也可以在凝胶中克隆培养，比如琼脂或黏性溶剂如 美希索(Methocel) 。凝胶的稳定性或美希索的粘滞性可确保子代细
毛细管技术
在一定密度的群体里，释放的胞内代谢物很快会和 周围培养基达到平衡，而孤立的一个细胞就不能做 到这一点。据此原理，Sanford等人发明了毛细管 技术：
毛细管本身能为细胞营造出类似细胞较高密度状态下的 局部环境 应用毛细管计数，集落可以处于独立的状态，能够依次 被分离培养
促进克隆生长的方法
如果不需要分离培养，只 用于定量分析，则可以将 集落固定、染色、计数。
换液
由于克隆培养期间细胞密度很低，因此对一周换一次液 的做法产生了争议；
换液的主要目的是弥补丢失的不稳定的营养物质(谷氨酰 胺)，以及补充降解了的生长因子；
但因为换液同时也增加了污染的危险，所以培养两周时 再换液是合理的，或至少半量换液； 形成的集落容易在培养皿的中央，这大多可能是因为接 种方法的原因，将细胞接种到已有培养基的培养皿的中 央或摇匀培养皿时都可使细胞趋向集中于中央，也可能 是由于温箱的共振作用造成的。
方案：稀释法克隆培养Leabharlann Baidu
概要：
低密度接种细胞，培养至集落形成，再进行细胞染 色(用于存活检测)或分离细胞，然后扩增为细胞株，用于 筛选。
无菌材料
培养基，0.25%胰蛋白酶，1ml、5ml、10ml、25ml吸 管，6cm、9cm培养皿，试管。
非灭菌材料
血细胞计数器或电子细胞计数仪
操作步骤
1. 细胞用胰蛋白酶消化以制备单细胞悬液，就克隆培养而言 细胞呈单个悬浮状态是基础—消化不充分会形成细胞团， 而过度则会降低细胞活性。 2. 在细胞消化期间，给培养皿编号，分出每步稀释用培养 基，可能需要四次稀释才能将原来单层细胞稀释至适于克 隆培养的浓度。 3. 待细胞变圆并开始脱落时，加入含血清或胰酶抑制剂的培 养基以终止消化，分散细胞。
细胞的克隆培养及筛选
克隆培养
利用克隆培养可以解决培养中的异质性问题，该技术对于连 续细胞系相对容易，但对大多数原代培养的细胞来说，由于 其成功率低而受到限制。 成功的范例：Clark和Paterman（1978）通过原代的克隆 培养从中国仓鼠肝内分离并建立了枯否氏细胞系；Zwain等 克隆培养出睾丸支持细胞(1991)；1990年Muirhead等人， Troyer等人通过克隆培养从肾组织中分离出肾小球旁细胞和 肾小球细胞; 正常组织原代培养的另一个问题是只能传有限的几代，当克 隆培养达到所需的数目时，细胞已经接近衰老：单个克隆细 胞与群体之间的关系，20次倍增可形成106个细胞（见图表）
①培养基：选择营养丰富的培养基，或选用针对不同细胞类 型的最适培养基； ②血清：通常胎牛血清优于小牛血清或马血清，选择使用高 贴瓶率的血清批号；
③激素：
胰岛素，1X10-10IU/ml，可以提高几种细胞类型的贴瓶率 地塞米松，2.5X10-5mol/L，10μg/ml，一种可溶性的合成的氢化可的 松类似物，可以提高鸡成肌细胞、人正常角质细胞、角质瘤细胞、 成纤维细胞和黑色素瘤细胞的贴瓶率，如果培养5天后撤掉地塞米松， 则可增加克隆的生长(集落的大小)，较低浓度(10-7mol/L)，有利于表 皮细胞的生长
贴瓶率的激活
细胞低密度培养时，大多细胞系细胞生存率都会降 低。
连续细胞系一般不会低于10% 原代细胞和有限细胞系为0.5~5%，甚至为0
低密度使细胞贴瓶率降低的原因：
由于细胞密度过低，缺乏释放的代谢产物，细胞需要更 多的营养物质 也可能是由于高密度培养时细胞产生的扩散性信号、调 控因子在密度低时会消失或变得过稀
微量滴定培养板
如果克隆培养的主要目的是分离不同的集落，那么将细 胞接种在微量滴定板上的效果会更好，克隆长起来后也 容易分离，但在早期必须注意观察，以保证标记好哪一 孔真正有单个克隆
提高单孔单克隆在统计学上的可能性，可以通过将接种 细胞的密度降低至每5或10个孔中可能有一个单克隆集落 的水平
例如：如果每毫升含100个细胞，贴瓶率为10%，则每毫升会有10个 集落形成，即每0.1ml有一个集落。在微量滴定板中每孔种0.1ml， 形成一个集落。如果将细胞稀释至每毫升10个细胞，理论上10个孔 中只会有1个孔能形成1个集落，而每孔中多于一个集落的可能性很 小。
胞不脱落集落。造血细胞通常是在悬浮培养条件下进行克隆培养，根据 其细胞种类和使用的生长因子，克隆培养形成的集落可以是由体内外群 体重塑能力很强的未分化细胞构成，或是有群体重塑能力弱的已分化细 胞构成，这样克隆培养就成了一种检测细胞增殖能力和鉴定干细胞性质 的方法。
克隆培养
连续细胞系的细胞由于发生了转化，在贴壁或悬浮克隆培养 时通常具有很高的克隆形成率。正常细胞贴壁培养的克隆形 成率也相当高，而悬浮培养时克隆形成率则非常低，根据这 一区别可通过悬浮培养来检测细胞的转化。 稀释法克隆培养(Puck and Marcus 1955)是应用最广泛的 方法。它是基于以下观察：将细胞系使之低于一定密度进行 培养，最终能够形成单独的集落。