3.抗菌药物的体内外活性评价方法

2. Epsilometer Test
特点： 新 综合了定性（易操作）及定量的特点， 可从含药梯度条上能直接读出MIC值 费用高限制了其应用。
3.稀释法
MIC测定是将细菌与系列稀释的抗菌药物 共同孵育18－24h，观察能抑制细菌生长 的最低浓度 ，MBC则是在此条件下，使 受试菌99.9%被杀灭的最低药物浓度。 MBC测定需要进行菌落计数。 实验用细菌浓度：1～5×105 CFU/ml(colony forming units)
Response Surface Approach
三、 联合药敏测定方法 2. 时间-杀菌曲线法
药物联合应用效果时间-杀菌曲线示意图
联合药敏-- 杀菌曲线法结果判断

测定抗菌药物联用（24～48h）效果时应遵循以 下标准： 与活性最强的成分相比，每毫升CFU的常用对数 值下降≥2定义为协同； 与活性最低的成分相比，每毫升CFU的常用对数 值升高≥2定义为拮抗； 与活性最强的成分相比，每毫升CFU的常用对数 值下降＞1且＜2定义为相加； 与活性最低者相比，每毫升CFU的常用对数值升 高＞1且＜2为无关。

菌液浓度：0.5～2.5×103cfu/ml
二、时间-杀菌曲线法

将受试菌与一定浓度的抗生素共同孵育，在不 同时间点进行菌落计数，以时间为横坐标，细 菌数的对数值为纵坐标所绘制的曲线；可用不 同抗生素浓度绘制多条杀菌曲线，如1/4，1/2， 1，2，4倍MIC，杀菌曲线的斜率反应出药物对 细菌的杀灭速度。

药敏报告的临床意义

敏感(Sensitive S)：表明该菌株所致感染， 用此药物正常剂量，除非存在禁忌症。

中介(Intermedium I): 此菌所致的感染可 以用此药，但需加大剂量。
耐药（Resistance R): 此菌所致的感染用 此药无效。

药敏试验折点的建立
MIC的分布 药代动力学和药效学 定 MIC的折点 临床疗效和细菌清除率 抑菌圈直径的分布 定 抑菌圈折点

曲线一般分为三个时相：延迟时、杀菌期 和恢复再生长期。可比较不同抗菌药物的 杀菌速度和持续时间。
杀菌曲线

通过杀菌曲线可以发现，在低于MIC值时， 杀菌曲线斜率为正值，随着药物浓度的 增加，斜率逐渐减小；当抗生素浓度为 MIC时，杀菌曲线有两种情况，一为曲线 斜率呈负值，另一为曲线近水平状，表 明前者有杀菌作用，为杀菌剂，而后者 则只是具有抑菌作用，为抑菌剂。

体内 ：
– ED50（动物） – 临床有效率与细菌清除率 – 抗生素后效应 – 血清杀菌滴度(SBA)
一、药物敏感性实验测定方法 MIC/MBC测定


NCCLS：National Committee for Clinical Laboratory Standards Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) 药物敏感试验：MIC测定
抗菌药物活性评价方法研究进展
山东省千佛山医院
孙淑娟
CONTENTS


抗菌药物敏感性实验测定方法
–MIC、MBC测定
杀菌曲线 联合药效测定
血清杀菌活性/滴度

抗菌药物对细菌形态影响研究进展
抗菌药物抗菌活性评价方法

体外：
– 药物敏感性实验

MIC/MBC测定
– 时间-杀菌曲线 – 联合药敏试验 – 抗生素后效应：PAE
抗菌药物分类---抗菌效果
抑菌剂 & 杀菌剂
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 Time(h) 3
Optical density
resistant bacteriostatic bacteriocidal
4
杀菌曲线

对于杀菌剂，随着浓度逐渐增加杀菌曲线 斜率的负值也逐渐加大，但当抗菌药物浓 度增加到一定程度后（如4MIC），再增加 其浓度又有两种可能，一则曲线斜率随之 增加，另一曲线斜率不在增加，前者杀菌 活性与浓度有密切关系，而后者杀菌作用 不完全依赖于抗生素浓度，分别称这两类 抗生素为浓度依赖性抗生素与浓度非依赖 性抗生素或时间依赖性抗生素。
杀菌曲线与抗菌药物PK/PD分类
9.5 9.5
9.5
LogCFU
8.5 7.5
8.5 7.5
8.5
7.5
6.5
6.5
6.5
control 1/4MIC
5.5 4.5
5.5 4.5
5.5
MIC 4MIC
4.5
16MIC 64MIC
3.5 2.5
3.5 2.5
3.5
2.5
1.5 0 2 4 6
1.5 0 2 4 6


纸片法:K-B法(定性法） 定量纸条法（E-test） 稀释法：常量法：试管稀释法(1－2ml) 微量法：肉汤稀释法(0.1-0.2ml)： 肉眼观察、OD、MTT、XTT 琼脂稀释法
1. 纸片法（Disk Diffusion Assay)




又称K-B法（Kirby-Bauer)：利用含一定浓度 抗菌药物的滤纸片贴附在涂布受试菌的琼脂平 板，孵育18-24h后，据抑菌圈的大小判定细菌 对抗生素的敏感性，该法简便，是临床抗菌药 物敏感性检测定wk.baidu.com的常用方法； 菌液浓度一般为104cfu/ml 。 抑菌圈直径解释标准。 报告(定性）：针对抑菌圈直径测量值报告敏 感、中介、耐药。 影响因素：琼脂成分、孵化温度、细菌接种量、 抗菌药物纸片含量。

–统计学的线性回归 –计算错误率：尽可能减少极重要误差(假
敏感率)
MIC的局限性

体外抗菌药物敏感测定虽能反应抗菌药物 的抗菌活性，但只表明抗菌药物在其一定 浓度的活性，不能体现抗生素杀菌的动态 过程及不同浓度抗菌药物的抗菌过程。 多用于科研

MIC测定-稀释法 真菌
NCCLS M-27 A，CLSI M-27A 念珠菌 NCCLS M-27 A2，CLSI M-27A2 M38-A 霉菌
1.5 0 2 4 6 8
Tobramycin
Ciprofloxacin
Ticarcillin
Time（h）
三、 联合药敏测定方法
1. 棋盘法-微量稀释法
图2 棋盘法表现两药协同作用
联合药敏--棋盘法结果评价

通过计算联合分数抑菌浓度指数 （Fractional inhibitory concentration index，FIC），判断联合 用药的结果。 FIC指数=MICA药联用/MICA药单用+MICB药联用/MICB药单用

联合药敏--棋盘法结果评价

目前国际上已报道了多种借助计算机软件来进 行统计处理的模型法，如RSA（Response Surface Approach）法 BI理论的评价参数△E为真菌的理论生长率与 实际生长率之差，又称为生长率差值法（△E 法）。

Response Surface Approach
联合药敏测定方法
时间-杀菌曲线法

时间-杀菌曲线法可提供以下信息：


药物抗菌活性的速度和程度；
药效学参数（如浓度-效应关系及后效应）； 抗菌药物联用时的药效关系（协同、拮抗、
相加或无关）。
四、血清杀菌活性/滴度





SBA：Serum Bactericidal Activity SBT: Serum Bactericidal Titer 方法：患者给药后一定时间（一般为峰浓度 时间）采血，测定能抑制细菌生长的最高血 清稀释倍数 样品：血样、胰液、肺泡液、尿液…. 国外应用情况 国内研究应用情况.

MIC测定方法及终点

MIC终点：
– 100%抑制，细菌 – 80%抑，真菌 – 50% 研究
肉眼观察 比浊(类OD) 比色：采用氧化-还原指示剂进行比色分析的终点判

读方法 噻唑蓝 （MTT) ，甲基四氮盐（XTT)。
结果影响因素
培养基及其所含阳离子（生理水平的 钙、镁离子影响氨基糖苷类的抗菌活 性、pH值、血清蛋白) 菌液浓度 培养温度与时间 观察与测定方法
血清杀菌活性/滴度

SBA与MIC的区别： 测定SBA的临床意义： 临床上对于一些难治性感染，如心内膜 炎、脑膜炎等，可以利用血清杀菌滴度 调整治疗方案,当SBA≧1：8时，对上述 难治性感染可获得较好的疗效。
五、抗菌药物对细菌形态影响 的研究方法进展
光镜：各种染色 电镜 激光共聚焦显微镜

FIC≤ 0.5 协同效应 FIC＞05-1 相加效应 FIC＞1-2 无关效应 FIC≥2 拮抗效应
联合抗菌作用
由于各种抗菌药物抗菌活性、抗菌谱不同， 在处理部分细菌感染时需要联合两种甚至 两种以上的抗菌药物。 有关抗菌药物联合作用的体外研究表明， 两种抗菌药物联合可以产生协同、相加、 无关与拮抗等四种结果。 一般杀菌剂与杀菌剂联合产生协同作用， 杀菌剂与抑菌剂联合产生拮抗作用。

白念
白色念珠菌.JPG
黑曲霉
THANKS