SDS-PAGE 银染步骤

1. 电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。

2. 固定：将凝胶浸泡在 25 ml 的固定液中，固定液充分覆盖胶。

放于摇床上室温摇动 15 分钟。

更换固定液，重复一次。

固定液的配制：超纯水：乙醇：冰醋酸=6:3:1.
3. 固定完成后，配制 10%乙醇，洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

4. 再用超纯水洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

5. 配制银染增敏工作液：取 50 ul Silver Stain Sensitizer（500×）加入到 25 ml 超纯水中，混匀。

6. 将步骤 4 洗好的凝胶置于银染增敏工作液中，室温下准确孵育 1 分钟（这里时间可以适当延长的），之后用超纯水洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒。

7. 弃去超纯水，将凝胶置于 Silver Stain 中孵育 30 分钟（我做的时候是孵育45min-1h）。

8. 配制终止液：5%冰醋酸。

9. 用超纯水快速洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒（时间不用很准确）。

10. 立即将洗好的凝胶浸没在 Silver Stain Developer 中，室温孵育 2-3 分钟，直至蛋白条带显示清晰（我做的时候室温孵育时间比较长，因为我也是为了找到差异条带打质谱的，10分钟甚至更长都是可以的，建议最好一直在旁边看着，直至出现满意的结果）。

11. 用终止液洗去凝胶上的 Silver Stain Developer 后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应10 分钟。

(注：孵育是摇床速度调到最小，洗涤时速度要加快，和western洗膜的速度一样就行)
用一般的SDS-PAGE胶就可以。

1. 分离胶(12%)
配制所需试剂所需体积
分离胶(12％) 30％丙烯酰胺 6.0 ml
1.5 mol/l Tris-HCl 3.8 ml
10%SDS 150 μl
10%过硫酸铵 150 μl
TEMED 6 μl
蒸馏水 4.9 ml
2. 浓缩胶(5%)
配制所需试剂所需体积
浓缩胶(5％) 30％丙烯酰胺 1.3 ml
1.5 mol/l Tris-HCl 1.0 ml
10%SDS 80 μl
10%过硫酸铵 80 μl
TEMED 8 μl
蒸馏水 5.5 ml
3. 分离胶缓冲液(pH8.9)
配制所需试剂所需体积
分离胶缓冲液Tris 36.6 g
1 mol/l HCl 48 ml
蒸馏水补足至100 ml
4. 浓缩胶缓冲液(pH6.7)
配制所需试剂所需体积
浓缩胶缓冲液（pH6.7）Tris 5.98 g
1 mol/l HCl 48 ml
蒸馏水补足至100 ml
5. 30%丙烯酰胺(pH≤7.0)
配制所需试剂所需体积
30%丙烯酰胺（pH≤7.0）丙烯酰胺29 g
甲叉-双丙烯酰胺 1 g
蒸馏水补足至100 ml
6. 10%过硫酸铵(W/V)：1g过硫酸铵溶于10ml水中，4℃保存数周，尽量现用现配。

7. 10%SDS：将10 g SDS溶于80ml重蒸水中并轻缓搅拌(室温低时需水浴加热溶解)，再定容至100ml，室温存放。

8. 样品缓冲液
配制所需试剂所需体积
样品缓冲液 1 M Tris-HCl（pH6.7） 5 ml
SDS 2.5 g
巯基乙醇 1 ml
溴酚兰0.05 g
蔗糖10 g
蒸馏水补足至100ml
9. 考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250用少量甲醇溶解后，用甲醇(40ml)-乙酸(10ml)水溶液稀释至100ml。

10. Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)
配制所需试剂所需体积
Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3） Tris碱15.1 g
甘氨酸94 g
10％（W/V）SDS 50 ml
去离子水补足至100 ml
凝胶配制所需试剂的母液不能放置太久，有条件的实验室可将母液保存在4度冰箱中，放置母液被微生物污染或者出现沉淀。