7.分子标记与遗传图谱

RAPD技术的基本原理
模板DNA经92-94℃变性解链后，在足够低 的温度下（35-37℃ ，一般低于40℃ ）于一 种随机引物（一般为十个碱基）退火，如果 两个退火位点足够近（约200-2000bp），且 分别位于互补的两条DNA链，通过PCR便可 扩增出DNA片段。 由于不同的物种或者品种等不同材料的基 因组DNA可能插入、缺失或者在退火的位点 发生碱基的改变，扩增产物的长度就有所不 同，可用电泳检测DNA扩增片段长度的多态 性。 • 分析DNA片段长度的多态性可以得到相应 的DNA遗传、分类、进化等信息。
⑧由于存在共迁移问题，在不同个体 中出现相同分子量的带后，并不能保 证这些个体拥有同一条（同源）的片 段； • 同时，在胶上看见的一条带也有可能 包含了不同的扩增产物，因为所用的 凝胶电泳类型只能分开不同大小的片 段，而不能分开有不同碱基序列但有 相同大小的片段。
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RAPD技术的优越性在于：
在人类中，这使生化机制不清楚的遗传 疾病的基因在特定染色体或染色体带型 中定位，并通过与标记相连锁追踪家谱。 对几种模式生物在国际范围内展开制作 遗传和物理图谱的工作，最终目的是确 定整个基因组顺序。 基因组作图、分析和测序的学科称为基 因组学(genomics)。
1.2 三种基因图
1.2.1 细胞遗传图 1.2.2 遗传（连锁）图 1.2.3 物理（分子）图
第七章 分子标记与遗传图谱
1. 基因作图 1.1 基因作图的目的 1.2 三种基因图 1.2.1 遗传或连锁图(genetic or linkage map) 1.2.2 物理或分子图谱(physical mapping) 2. 遗传作图标记 2.1 基因标记 2.2 DNA分子标记 2.2.1 限制性片断长度多态性(RFLP) 2.2.2 酶切扩增多态性序列(CAP) 2.2.3 随机扩增多态性DNA (RAPD) 2.2.4 扩增片段长度多态性标记(AFLP) 2.2.5 简单序列长度多态性(SSLP) 2.2.6 单核苷酸多态性(SNP) 2.2.7 序列标记位点(STS)
2.2.2 酶切扩增多态性序列
(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP)
相似于RFLP标记，具共显性的特点。是通 过PCR及DNA Blot杂交的方法来检测限制性 位点的多态性。 CAP标记是以PCR为基础的；而RFLP是 以Southern杂交为基础的。 首先基因组区域通过特异引物（要求有序 列信息）进行PCR扩增。可将RFLP探针的 两端测序，合成引物进行PCR扩增。 扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解 产物，产生多态性。
RFLP标记是指用限制性内切酶酶切不
同个体基因组后，含同源序列的酶切后 段在长度上的差异。 • RFLP能用于在DNA水平上直接测定遗 传变异。 • 限制性内切酶的位点可能存在于一个生 态型中，而在另一个生态型中不存在。 RFLP标记的缺点： 需要相对大量的基因组DNA，用于被 不同的限制性内切酶的切割。 精确的RFLP图谱通常必须使用F3代个 体的pool。
3. 物理图 3.1 限制性作图(restriction mapping) 3.2 基于克隆的基因作图(clone-based mapping) 3.3 荧光标记原位杂交(Fluorescent in Situ hybridization,FISH） 3.4 序列标签位点(sequence tagged site ,STS)作 图 4.人类基因组计划 4.1 人类基因组计划的总目标和内容 4.2 基因组计划已取得的成就 4.3 基因组测序的新技术 4.3.1 脉冲场电泳(pulsed field electrophoresis) 4.3.2 大分子克隆技术 4.3.3 新的DNA测序技术 4.4 新的DNA测序技术
1.2.3 物理或分子图谱(physical mapping)
采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、 基因或克隆标定在基因组实际位臵。以真实单 位（碱基对、千碱基对、兆碱基对）标定。 • 物理作图有最精细的分辨率，是作图计划的最 终目的。然而，由于高等真核生物基因组只有 一小部分被表达，有些物理作图方法被用来鉴 定转录的序列。 多态型分子标记，如限制性片断长度多态性和 包含小卫星DNA序列标记位点可以同时用于连 锁分析中的遗传标记和作为核酸探针鉴定的物 理克隆。 • 同时，原位杂交使物理克隆能精确分配到细胞 遗传作图的染色体条带上。
2. 遗传作图标记
任何一类图谱都有可识别的标记，以便寻找 目标的方位和彼此之间的位臵。 • 遗传标记在遗传学建立和发展过程中有着举 足轻重的作用，同时也是作物遗传育种的重要 工具。 随着遗传学的发展，遗传标记的种类和数量 也在不断增加，主要分为4种类型，即形态标 记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。 前三种标记都是以基因表达的结果（表现型） 为基础，是对基因的间接反映；而DNA分子标 记则是DNA水平遗传变异的直接反映。
RAPD技术的特点
①不需DNA探针，设计引物也不需要知 道序列信息； ②用一个引物就可扩增出许多片段（一 般一个引物可扩增6－12条片段，但对 某些材料可能不能产生扩增产物）， 总的来说RAPD在检测多态性时是一种 相当快速的方法； ③技术简单，RAPD分析不涉Southern杂 交、放射自显影或其它技术； ④不像RFLP分析，RAPD分析只需少量 DNA样品；
①技术简便； ②不需要物种特异之引物； ③花费相对较低； ④多态性水平高； ⑤对整个基因组进行巡查； ⑥只需少量DNA样品。
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2.2.4 AFLP标记
(Amplified Fragment Length Polymorphisms)
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遗传图以绝对单位被标定，反映了通 过重组或染色体片断化标记分离的可能 性，遗传作图依赖的原理是两个基因座 出现在同一DNA片断的机会随它们之 间的距离增加而减小。 遗传图谱分辨率在细胞遗传和物理作 图之间。 另外，重组频率在各物种中并不一样， 因此，遗传图谱在不同的物种中反映了 不同的物理距离。 BACK
CAP标记优点： 仅需少量的基因组DNA，一个 单个的叶子就可提供足够的DNA 用于CAP分子标记的分析。
2.2.3 随机扩增多态性DNA
(Random Amplified Polymorphic DNAs，RAPD)
RAPD即随机扩增多态性DNA，RAPD 分析技术是采用随机核苷酸序列为引物 ，扩增基因组DNA的随机片段而获得的 一种新的分子标记； • 或者说是用一个(有时用两个)随机引物( 一般8－10个碱基)非定点地扩增DNA片 段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。 • 它在基因组图谱构建、基因的快速定位 、阐明物种亲缘关系、种群生物学、分 子生态学等方面得到了广泛的应用。
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1.2.1 细胞遗传图谱
是通过将可观察到的染色体重排和 表型相联系起来而产生的。这一类 图谱分辨率低，在少数物种中应用， 如哺乳动物和果蝇。 • 简单基因组的细胞遗传作图用来确 定它们物理性质差异的位臵。
1.2.2 遗传或连锁图
(genetic or linkage map) 采用遗传学分析方法将基因或其它 DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。 这一方法包括杂交实验和家系分析。 பைடு நூலகம்遗传图距单位为厘摩（cM），每单 位厘摩定义为1%的交换率。
1. 基因作图
1.1 基因作图的目的 基因作图是将基因分配到染色体的基因 座上。 •通过对很多基因和其它标记相对位臵的 作图，可能产生一个染色体图谱或整个基 因组的图谱。 •基因作图可帮助人们理解与开发生物性 状的遗传性质，特别是通过遗传连锁将一 种性状的遗传与另一种相联系，或者通过 将表型差异与染色体结构的改变联系起来。
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2.2 DNA分子标记
基因标记是非常有用的标记，但并非理 想标记。原因之一是，高等生物可用作 标记的基因十分有限，许多性状都涉及 多基因。 此外高等生物基因组存在大量的间隔区 ，用基因作为标记将在遗传图中留下大 片的无标记片断。因而会产生不完整的 遗传图，必须寻找其他更有效的标记。
分子标记(molecular marker)是指可遗传 的并可检测的DNA序列；从本质上说， 是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作 为标记。 • DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表 现，依其所用的分子生物学技术，大致 可分为以Southern杂交技术为核心的分 子标记和以PCR技术为核心的分子标记。 • 另外，由于其中有些DNA标记和重复序 列密切相关，有时将这种直接源于重复 序列的标记单独出来，以突出其独特性。
RFLP标记的优点：
① 无表型效应： RFLP标记的检测不 受环境条件和发育阶段的影响。 ② 在等位基因之间是共显性的，因此 在配制杂交组合时不受杂交方式的 影响。 ③ 在非等位的RFLP标记之间不存在上 位效应，因而互不干扰； ④ RFLP标记源于基因组DNA的自身 变异，在数量上几乎不受限制。
理想的分子标记必须达到以下几个要求： ①具有高的多态性； ②共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中 杂合和纯合基因型； ③能明确辨别等位基因； ④遍布整个基因组； ⑤除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布 于整个基因组； ⑥选择中性(即无基因多效性)； ⑦检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； ⑧开发成本和使用成本尽量低廉； ⑨在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交 换)。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足 以上所有要求。
2.2.1 限制性片断长度多态性
（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLPs）
RFLP是迄今为止发现最早和应用最广
泛的最具代表性的基于Southern杂交技术 的分子标记。 其技术原理是检测DNA在限制性内切酶 酶切后形成的特定DNA片段的大小，因此， 凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突 变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的 重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间 的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。
该标记技术是利用限制性内切酶酶解
不同生物体的DNA分子后，用特异探 针进行Southern杂交通过放射自显影 或非同位素显色技术来揭示DNA的多 态性。 • 其中探针为单拷贝或低拷贝的DNA克 隆(cDNA或基因组DNA)，一般选择单 拷贝探针。它有如下特征：
①处于染色体上的位臵相对固定； ②同一亲本及其子代相同位点上多态 性片段特征不变； ③同一凝胶电泳可显示不同多态性片 段，具有共显性特点； ④RFLP标记的检测不受环境条件和发 育阶段的影响，即无表型效应。
2.1 基因标记 2.2 DNA分子标记 2.2.1 限制性片断长度多态性 2.2.2 酶切扩增多态性序列 2.2.3 随机扩增多态性DNA 2.2.4 AFLP标记 2.2.5 简单序列长度多态性 2.2.6 单核苷酸多态性 2.2.7 序列标记位点
2.1 基因标记
在经典遗传学中，研究一种性状的遗传必须 要求同一性状至少有两种不同的存在形式或称 表型。 • 每个相对性状如豌豆高与矮，都有一对不同 的等位基因(allele)控制。 • 最初人们识别的指令表型的基因都是通过肉 眼观察辨认的。 但很快遗传学家即意识到可见的表型性状数 目十分有限，尤其是当多个基因影响同一性状 时，遗传分析往往陷入困境。 • 为了使遗传图具有更强的综合性，必须发现 大量易于区分的、较为单一的性状，具有生化 特征的表型具备上述要求。
⑤成本较低，因为随机引物可在公司买 到，其价格不高； ⑥RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性遗传的），这样对扩增产物 的记录就可记为“有/无”，但这也意 味着不能鉴别杂合子和纯合子； ⑦RAPD分析中存在的最大问题是重复 性不太高，因为在PCR反应中条件的 变化会引起一些扩增产物的改变；但 是，如果把条件标准化，还是可以获 得重复结果的；