内质网源性转录因子对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

内质网源性转录因子对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的研究内质网源性转录因子（CHOP）对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法54只大鼠随机分为三组：假手术组（n=18）、缺血再灌注组（n=18）、间歇性低氧+缺血再灌注组（n=18）。通过球囊结扎冠状动脉方法制作心肌缺血再灌注动物模型，将老鼠暴露在低氧循环中。制作间隙性低氧动物模型，用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡，术后Western blot法检测CHOP蛋白表达。结果假手术组、缺血再灌注组及间歇性低氧+缺血再灌注组的心肌细胞凋亡率分别为（4.16±2.27）%、（38.68±4.58）%、（18.72±6.71）%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；假手术组、缺血再灌注组及间歇性低氧+缺血再灌注组的CHOP蛋白表达分别为（1.612±0.284）%、（0.946±0.372）%、（0.547±1.429）%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论间歇性低氧在大鼠心肌缺血损伤中具有保护心脏的作用，其保护机制与CHOP蛋白表达下降有关。

标签：内质网源性转录因子；间歇性低氧；缺血再灌注

低氧是心肌缺血的主要因素，在缺血性心脏疾病中有重要的作用。低氧损伤的严重程度除了与低氧刺激的强度和持续时间有关，同时与心脏对低氧的耐受性有关[1-2]。因此，增加心脏对缺血、缺氧的耐受性来达到心脏保护的目的，一直是基础和临床医学研究关注的热点之一。本实验在研究间歇性低氧状态下，内质网源性转录因子（CHOP）表达对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂材料

取8～10周左右雄性SD大鼠54只，体重（200±20）g，由南昌大学动物实验中心提供。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德公司）；蛋白浓度测定标准品（普利莱公司）；兔抗大鼠CHOP抗体（美国Bioword公司），碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗兔IgG（美国Santacruz公司），BX41型光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

1.2动物分组及模型建立

将实验动物分为三组。

假手术组（n=18）：含氧量正常者作为假手术组[3]，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。

缺血再灌注组（n=18）：参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法，采用气管插管、人工呼吸、开胸、冠状动脉左前降支上垫扎充水球囊阻断血流的方法造成心肌缺血，通过塌陷气囊进行心肌再灌注，复制并制作大鼠缺血再灌注模型。

间歇性低氧+缺血再灌注组（n=18）：将大鼠暴露在每日4次的低氧循环中（每次接受2 min 6%～8%低氧，3 min氧和处理，循环5次），处理14 d，制作间歇性低氧模型。建立间歇性低氧动物模型后，再制作缺血再灌注模型。

1.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

通过末端缺口标记技术（terminal deoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）测定凋亡细胞。试验结束后将心肌组织石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书标记染色。未凋亡的细胞核为深蓝色，凋亡的细胞核为棕黄色。在高倍镜下随机选择10个视野，每个视野中选100个细胞，统计阳性细胞数。将阳性细胞数相加，计算阳性细胞百分率。

1.4 Western blot法检测CHOP蛋白表达

制模结束后处死手术处理后的存活大鼠。采用Western blot方法测定CHOP 蛋白，提取各组心肌组织，采用考马斯亮蓝测定蛋白质定量。蛋白变性后，将含有20 μg蛋白的样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将凝胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭，用特异性CHOP抗体孵育，4℃过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，增强化学发光法显色[4]。以β-actin作为蛋白质完整性及等量的对照。

1.5统计学分析

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。非正态分布数据经校对转换为正态数据后进行统计。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠心肌细胞凋亡率的比较

TUNEL法检测显示，凋亡心肌细胞核为棕黄色，染色质凝聚、浓缩，而正常心肌细胞的核染为蓝色。假手术组凋亡的细胞极少；缺血再灌注组见一定量的凋亡细胞；间歇性低氧+缺血再灌注组可见少量凋亡细胞，各组大鼠心肌细胞凋亡率为（4.16±2.27）%、（38.68±4.58）%、（18.72±6.71）%，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2各组心肌组织CHOP蛋白表达的比较

Western blot法检测各组心肌组织CHOP蛋白水平，假手术组、缺血再灌注组、间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP蛋白表达分别为（0.162±0.284）、（0.946±0.372）、（0.547 ±1.429），与假手术组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明

显下降（P＜0.05）；与假手术组比较，间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP组蛋白表达升高（P＜0.05）。

3讨论

心肌缺血再灌注损伤指在短时间心肌血液供应中断，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生更严重的损伤。早期流行病学调查和动物实验发现，低氧适应可以增加心脏对缺血缺氧损伤的保护作用[5-9]，然而目前间歇性低氧的心肌保护作用机制的研究还是非常匮乏。间歇性低氧适应类似缺血预适应，具有较明显的心脏保护作用，可以增强心肌对缺血再灌注损伤的耐受性，减轻细胞凋亡，限制心肌梗死面积，抗心律失常，以及促进缺血再灌注心脏舒缩功能的恢复[10-13]。本实验建立间歇性低氧模型，发现间歇性低氧预处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤。

CHOP是一种内质网应激特异性转录因子，在哺乳动物细胞中广泛表达，是内质网应激信号途径中非常重要的调控因子之一，也是内质网应激与细胞凋亡之间存在的重要信号分子[14-16]。生理状态下，细胞胞浆中有低水平表达CHOP，在内质网应激时，表达明显增加。可以从胞浆向胞核转移，同时调控其他基因表达[17-19]。

本实验通过检测低氧处理后各组细胞凋亡率及CHOP蛋白表达，通过Western-blot检测，发现假手术组CHOP蛋白含量及心肌凋亡率较低；缺血再灌注组CHOP蛋白及心肌细胞凋亡率明显升高；间歇性低氧+缺血再灌注组较缺血再灌注组CHOP蛋白含量下降，心肌凋亡率下降，提示间歇性低氧处理后，低氧可以减少缺血再灌注后CHOP蛋白表达，CHOP蛋白在内质网应激中能诱导细胞周期阻滞，同时通过多种途径促进心肌细胞发生凋亡，CHOP蛋白表达下降，进而心肌细胞凋亡减少，最终达到保护心肌缺血再灌注损伤的目的，其内在机制值得进一步探讨与研究。

[参考文献]

[1]Lishmanov YB，Naryzhnaya NV，Maslov LN，et al.Functional state of myocardial mitochondria in ischemia reperfusion of the heart in rats adapted to hypoxia[J].Exp Biol Med，2014，256（5）：645-658.

[2]Zhang Y，Zhong N，Gia J，et al.Effects of chronic intermittent hypoxia on the hemodynamics of systemic circulation in rats[J].JPN J Physiol，2004，54（1）：171-174.

[3]Meng XY，Yu HL，Zhang WC，et al.ZFP580，a novel zinc-finger transcription factor，is involved in cardioprotection of intermittent high-altitude hypoxia against myocardial ischemia-reperfusion injury[J].PLoS One，2014，10（4）：231-237.

[4]赵秀梅，孙胜，刘秀华.垫扎球囊法复制大鼠在体心肌缺血/再灌注模型[J].中国微循环，2006，11（3）：206-208.