泡桐属DNA条形码的筛选与鉴定研究

泡桐属DNA条形码的筛选与鉴定研究

泡桐属(Paulownia)是玄参科(Scrophulariaceae)中的一个属,树种为乔木。泡桐是原产于中国的重要速生用材树种和绿化树种之一,发展泡桐生产在国民经济中有重要价值。

目前泡桐存在优良基因资源容易流失,有些种群数量较少的野生资源的极具减少,商品用材品种混乱,用材品质不一等严重问题,需要得到准确的鉴定,DNA

条形码技术是当下较好的解决途径之一。DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种基于DNA分子进化原理,利用标准DNA片段和现代分子系统学的原理和方法对“传统物种”进行快速、准确和自动化的身份鉴定的最新生物学技术。

DNA条形码类似于超市里不同的商品对应的可扫描条形码。本研究以泡桐属为研究对象,利用DNA条形码技术,解决泡桐属密切相关种的鉴定问题,对于泡桐属植物近缘种鉴定、优良用材亲本选择具有较高参考价值。

同时筛选和建立泡桐属DNA条形码,以期为构建泡桐属植物的可视数字化的数据库奠定基础。本研究选取叶绿体、核基因、线粒体基因上的rps16、Trn K、rps2、rbc L、ITS2、ETS、nad1 intron2 DNA片段总计8个,提取泡桐属12种2变种共51份材料的DNA,进行PCR扩增及其产物直接测序,通过扩增效率和测序成功效率,用以研究DNA条形码片段在泡桐属中的通用性,同时分析其序列特征;本研究重点筛选了5个DNA条形码候选序列rps16、Trn K、ITS2、ETS,Trn L-F,用于泡桐属DNA条形码的分析和鉴定研究。

研究结果如下:(1)8个DNA条形码片段在泡桐属中的通用性分析:PCR扩增效率和测序成功率是评价DNA条形码序列的2个重要指标。rps16、Trn K、trn L-F、rps2、rbc L、nad1intron2、ITS2、ETS 8个DNA片段的PCR扩增效率为100%,

测序成功率为69.8%~100%。

发现各DNA片段在泡桐属中均显示出较好的通用性,故可将其作为泡桐属DNA条形码候选序列开展进一步实验。(2)DNA条形码序列特征分析:8个DNA片

段的全序列比对排列后的长度分别为239 bp~1828 bp;总变异位点数分别为2~84个,其中碱基替换位点数分别为2~83个。

GC含量分别为33.14%~72.19%。其中Trn K序列分析表明,在兰考泡桐,其中在1660 bp的位点插入G,被鉴定。

其中ITS2序列分析表明,山明泡桐在188 bp位点插入A,作为山明泡桐的特异位点被鉴定。其中ETS序列分析表明,楸叶泡桐在191 bp位点上碱基缺失(C

→-),238 bp位点上(G→A),304 bp位点上(A→C)。

楸叶泡桐因为这些特异序列特征,可以被鉴定。综上所述,rps16、Trn K、ITS2、ETS序列的变异位点较多,说明它们在泡桐属中的进化速率较快,可用于泡桐属

的系统学和分类学的研究。

(3)泡桐属DNA条形码的筛选和鉴定:通过种内种间的变异性,Barcoding gap 的分析,种的鉴别效率来衡量rps16、Trn K、ITS2、ETS Trn L-F 5个DNA片段的有效性。结果如下:rps16序列的种间变异变异度为0.027%,平均变异(Theta prime)为0.031%,种间最小变异为0;种内变异度为0.021%,平均变异(Theta)为0.025%,种内最大变异(Coalescent depth)为0.052%。

Barcoding gap图示rps16存在barcoding gap。通过BLAST l方法鉴定效率达13.33%。

Trn K序列的种间变异变异度为0.091%,平均变异为0.090%,种间最小变异

为0.012%;种内变异度为0.048%,平均变异为0.052%,种内最大变异为0.063%。

通过BLAST l方法显示Trn K序列的鉴定效率达21.42%。

ITS2序列的种间平均变异为2.096%,种间最小变异为0.186%;平均变异为0.822%,种内最大变异为1.354%。总体来说,种间的变异较大,种内变异较小。

barcoding gap图显示ITS2序列存在barcoding gap。BLAST l方法对ITS2序列鉴定效率达50%。

ITS2二级结构分析图显示兴山泡桐具有4个茎环,优先鉴别出来;台湾泡桐,华东泡桐均具有5个茎环,结构很相似,但还是有细微的区别,如相比华东泡桐的结构,台湾泡桐的结构在最长的碱基对上,多了一个内环。这充分证明了ITS2二级结构的分析,对于泡桐的鉴别具有重要意义。

综合发现ITS2序列可以做为泡桐属物种的候选DNA条形码片段。ETS种间变异变异度为3.555%,平均变异为3.906%,种间最小变异为0.544%;种内变异度为1.697%,平均变异为1.542%,种内最大变异为2.895%。

总体来说,种间存在较大的变异。BLAST l和Nearest Distance方法显示ETS 的鉴定效率达28.57%,有一定的鉴定能力。

Trn L-F序列的种间变异变异度为0.142%,平均变异为0.132%,种间最小变异为0.008%;种内变异度为0.096%,平均变异为0.065%,种内最大变异为0.127%。总体来说,种内种间的变异都不大。

所示序列种内变异和种间变异重叠比列大,无明显的的barcoding gap。综合理想条形码的指标分析揭示出:rps16、Trn K、ITS2、ETS片段适合作为泡桐属的DNA条形码候选序列。

利用Trn K+ITS2+ETS复合片段的序列比对,鉴定出泡桐属9种2变种,本研究推荐以Trn K+ITS2+ETS复合片段,作为泡桐属的DNA条形码候选序列。