端粒酶课件

对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。
细胞的死亡过程分为两个阶段, 即第一致
死期M1（mortality stage1, M1）和第二致死期M2
（mortality stage2, M2）。
当端粒缩短至一关键性长度2kb-4kb 时,染 色体的稳定性就会遭到破坏,细胞开始衰老进 入M1期。
第一节 端粒与端粒酶
一、端粒的结构与功能 端粒研究的模式生物：四膜虫
四膜虫有两个细胞核。小核很稳定，含5对染色体， 用于生殖传代。而大核在接合细胞的发育过程中， 染色体断裂成200-300个小染色体，DNA从染色体上 断裂后通过复制更是形成高达～10000个小染色。
四膜虫： 端粒DNA是由简单重复序列组成的一段核酸。
端粒以GT富集的形式延伸在CA富集链上。G 尾部由于CA富集链的有限降解而产生。
研究发现，端粒DNA序列既有高度的保守性， 如原生动物、真菌、高等植物及高等动物中期 序列都很相似，又具有种属特异性，如四膜虫 重复序列为GGGGTT,草履虫为TTGGGG,人类 和哺乳动物为TTAGGG.
几乎所有生物的端粒 重复序列可以写成： Gn(Ａ/Ｔ)m的形式。
端粒的结构和功能
通过原位 杂交技术, 清晰可见 位于染色 体末端的 端粒结构
端粒的功能
1 端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的 一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避 免了端粒对端融合（end-end fusion）以及染色体 的丧失。 2端粒DNA复制的特点是在每次DNA 复制中，每条 染色体的3`端均有一段DNA(一段端粒）无法得到 复制，随着细胞每次分裂，染色体3`末端将持续丧 失50-200bp的DNA，当端粒缩短到一定程度，细 胞停止分裂，进入静止状态，故有人称端粒为正常 细胞的分裂时钟（mistosis clock)。
的转座子获得诺奖）注意到，在减数分裂后期偶
然产生的染色体断裂很容易重新融合起来形成“桥
”。在紧接着的有丝分裂中，这种染色体“断裂－
融合－桥－断裂”的循环不断继续.
推断：染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂
末端，它应该有一个特殊的结构来避免染色体之
间的相互融合。
两名遗传学家Muller和Mcclintock分别在不同的实 验室用不同的生物做实验发现，染色体末端结构对 保持染色体的稳定十分重要，Muller将这一结构命 名为端粒（telomere）,这是由希腊语“末端” （telos）及“部分”（meros）组成的.
端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。
端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸－蛋白复
合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。 端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA为模 板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳定性。 许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影响细 胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、 癌变、凋亡、衰老。
在M1期细胞对生长因子等失去反应，产
生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查
点（cell cycle checkpoints）发送周期停止
信号，DNA合成停止，DNA 断裂,活化p53
依赖或非p53 依赖的DNA 损伤途径。
并诱导细胞周期依赖性激酶（CDK）抑
制物如p21 ,p27产生,导致细胞G1期生长停
(Elizabeth Blackburn)、美国巴尔的摩约
翰· 霍普金斯医学院的卡罗尔-格雷德(Carol Greider)、美国哈佛医学院的杰克· 绍斯塔克 (Jack Szostak)以及霍华德休斯医学研究所， 以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的
机理。
2009年诺贝尔生理学或医学奖
伊丽莎白-布莱克本 卡萝尔-格雷德 杰克-绍斯塔克
热休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT转录后修饰的 蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。
PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。
⑶ 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端 粒酶的功能有关。Est1p 足以使端粒延长。但是,在无 Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端 粒长度。
衰老钟，这限定了细胞分裂的次数，也就限定了生物的寿
命。
因为高等生物是由一个受精卵细胞分裂而形成的，它
一分为二、二分为四、以此类推的增殖，组成胚胎，再
分裂而成人。如果细胞不能再分裂了，那么个体就出现 衰老现象。这就像一座大厦，它的寿命很大程度上与组 成它的砖块有关。
端粒DNA复制的特点是在每次DNA 复制中，
端粒酶逆转录酶（TERT）
端粒酶RNA(hTR)
端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶 组分。端粒酶RNA含有与同源端粒DNA 序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H 切割此模板区,能使体外消除端粒酶 延长端粒的功能。
hsp90
端粒酶结合蛋白（TEP） TEP1、生存动力神经细胞基因(SMN) 产物、
端粒与端粒酶
南通大学医学院病理教研室
周家名
人体是由细胞组成的，人有衰老，细胞是否也有衰老呢？
细胞是有寿命的，这是细胞学家海弗列克
（Hayflick）在四十年前发现的，他培养人体的成纤维细 胞，即使在营养充分供给的情况下，细胞分裂到50代左右 就停止活动了，真正地进入衰老期，这一发现似乎告诉人 们在细胞内有一口
每条染色体的3`端均有一段DNA(一段端粒）
无法得到复制，随着细胞每次分裂，染色体3`
末端将持续丧失50-200bp的DNA，当端粒缩
短到一定程度，细胞停止分裂，进入静止状
态，故有人称端粒为正常细胞的分裂时钟
（mistosis clock)。
1939年,Barbara McClintock女士（因为发现玉米
㈡ 端粒酶的功能
端粒酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列， 具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合 酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。
第二节
端粒－端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响
“端粒－端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永 生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的 端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。 相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永 生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶
ELiz实验用四膜虫的核抽提液与体外的端粒 DNA进行温育，证明确实存在一种酶能够延伸 端粒DNA，这种酶后来被命名为端粒酶 （telomerase)。 Morin从人的宫颈癌上皮细胞株Hela中鉴定了端 粒酶的存在，并证实它是一种核糖蛋白。
㈠ 端粒酶的结构
端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA
响,与c-myc 引起的直接的转录激活一致。 但癌基因c-myc 不是唯一与hTERT基因调节有关的 转录因子。
近期研究表明,Sp1 协同c-myc 激活hTERT
的转录,可能还有其他因子,如Bcl-2 抗凋亡基
因、E6HPV16 型蛋白，以及经过一些蛋白激酶
的磷酸化使hTERT 上调。但在诸多不同类型的
癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基
因, 并可与H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT
等癌基因协同作用, 促进细胞无限增殖, 获得永 生化并发生癌变。
c-myc 与hTERT
Fujimoto等用c-myc 反义寡核甘酸转染白血病
细胞后, 这些细胞中端粒酶活性均能被下调, 而c-
myc 正义寡核甘酸无此作用。
直到1985年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒 的结构为极简单的6个核苷酸序列的多次重复，以 后又发现了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。
2009年诺贝尔生理学或医学奖
诺贝尔瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，将 2009年诺贝尔生理学或医学奖授予美国加利福 尼亚旧金山大学的伊丽莎白· 布莱克本
在一种端粒结合蛋 白TRF2蛋白催化下 ，端粒（人）的3’ 单链末端（G尾）重 复取代了双链体 DNA中的同源序列 以形成一个环。 TRF2蛋白与其它蛋 白一起形成能稳定 染色体端部的复合 物。
没有游离的末端可能是使染色体末端稳定的关键 右图真实的 显示出端粒 在染色体末 端形成一个 特殊的DNA 环。
2、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)
TERT是端粒酶活性所必须的。作为 RNA依赖的DNA聚合酶，区别于一般的蛋白 逆转录DNA聚合酶，TERT可以识别单链富 含G的寡核苷酸引物，以其RNA组分的碱基 为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对， 在合成、延伸碱基序列中起催化作用。
Wang等研究发现c-myc在正常人乳腺上皮细胞和 二倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性, 并能延长这些 细胞的寿命。 因此认为癌基因c-myc为一重要的端粒酶激活剂。
存在于hTERT核心启动子中有两个重要的c-myc 结 合位点(CACGTG,亦被称为E 盒)。c-myc 诱导的hTERT
表达起始速度快,不受细胞增殖或额外的蛋白合成的影
瘤细胞中,致hTERT上调的基本激活剂是c-myc。
3、端粒酶相关蛋白(TEP)
⑴ 端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白， TEP1 缺失导致rRNA 水平的显著降低以及TEP1 和rRNA 的丢失,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。 ⑵ 生存动力神经细胞基因(SMN) 产物
二、端粒酶的结构与功能
在端粒酶被发现以前，人们就推测生殖
细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种
维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是
由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临
着致死性缺失（deletion）的危险。
这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长 期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着 每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断 再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的 酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功 能，能使已缩短的端粒延长。
人的端粒重复序列为 TTAGGG
端粒的结构
端粒DNA由两条互相配对的DNA 单链组成, 其 双 链 部 分 通 过 与 端 粒 结 合 蛋 白 质 TRF1 和 TRF2 结合共同组成t环(t loops)。这种t 环特殊 结构可维持染色体末端的稳定,保持染色体及其 内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复 制。缺少端粒的染色体不能稳定存在。
、
PinX1、 Est1p 和Est3p
端粒酶通过引物特异识别位点，以自身RNA为模 板，在染色体末端合成端粒DNA，使端粒得以延 长，为后续DNA聚合酶合成完整的染色体提供了 平台。
1、端粒酶RNA(hTR) 哺乳动物端粒酶RNAs(hTR和mTR)在许多组织的不 同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛 表达。 体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要， 影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端 粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的 末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。 端粒酶RNA转录模板功能： 远端区参与和底物的结合。 近端区能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要。 模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶 相关因子Est1p和Ku 结合。
TERT内的N-残基对多种功能是重要的,
包括与端粒酶RNA结合、端粒酶RNA 装配
和催化作用、与p53 的相互作用和细胞永
生化。
TERT的C-残基也在人类原始纤维母细
胞的永生化、端粒组装的竞争、核仁内定 位、引物结合和渐进性延长等方面起重要 作用。
几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT 基因, 哺乳动物TERT 的转录由许多转录因子、激 素和细胞外信号严格控制。不同的转录因子调节 hTERT在不同的细胞内含物中的表达。
和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA聚合酶。它是
一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖 方式每次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶,由三 个亚单位组成：
端粒酶RNA(hTR)
端粒酶逆转录酶（人类TERT（hTERT）基因为一单拷贝基因,定位于5p15. 33 , 具有7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T。 破坏TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短。