【精品文档】端粒和端粒酶
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为什么染色体的自然末端不容易相互融合？
Assumptions
染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末 端,它有一个特殊的结构来避免染色体之间的相 互融合.
科学家Hermann Muller将这种特殊结构命名 为端粒(Telomere,在希腊语中,telos表示末 端,meros表示片段).
Experiments
Def. 存在于染色体末端的一段 特殊的DNA重复序列
端粒和端粒结合蛋白组成核蛋 白复合物，广泛存在于真核生 物细胞中；
不同种类细胞的端粒重复单位 不同，大多长约5—8bp;
端粒的结构与功能具有保守性.
端粒的功能
保护染色体 末端
A
B
防止染色体 复制时丢失
决定细胞寿 命
C
E
TPE效应
固定染色体 位置
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
这种酶活性不依赖于DNA模板,只 对四膜虫和酵母的端粒DNA进行 延伸,而对随即序列的DNA底物不 延伸;并且该活性不依赖于DNA聚 合酶.
而同源重组对序列没有特异性要求, 并且依赖于DNA聚合酶的活性.
至此,她们澄清了这两种假说,证明 了有一种酶来延伸端粒DNA,即端 粒酶(telomerase)
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
四膜虫在接合细胞的大核发育过程中,大核产生了 非常丰富的小染色体,每一个小染色体都在末端 加上了端粒,可以推测:如果“酶”的假说成立,此 时细胞内的酶活性应该是非常高的.
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温 育,试图在体外检测到这个酶的活性,看到端粒 的延伸.
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
经过不断优化条件,尤其是把底物换成体外合成的高浓度 的端粒DNA后,Carol通过曝光x光片,清楚地看到了“酶” 的活性:在测序胶的同位素曝光片上,端粒底物明显被重 新加上了DNA碱基,而且每六个碱基形成一条很深的带, 与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合.
端粒酶RNA亚基的发现
Daniel Gottschling利用TPE效应设计出实验,筛选酵母RNA亚基 基因: 把URA和ADE连个基因通过遗传重组的方法置入端粒区域,由于 TPE效应,URA和ADE不表达. 酵母只能在含有uracil的培养基中生长,且克隆是红色的.
再转入cDNA表达库,某些调控端粒长度的基因通过过表达可以改 变端粒的长度.如果端粒长度变得足够短,TPE效应就会消失,URA 和ADE两个基因就会启动表达. 这种短端粒的酵母能够在不含有uracil的培养基中生长,并且酵母克 隆显示出白色
人工染色体
端粒序列的发现使Jack Szostak有机会把 线性质粒末端连接到四膜虫的端粒DNA ， 然后再倒入酵母细胞中。奇迹发生了：线 性质粒不再被降解，而是在细胞内稳定存 在并复制。 这是人工染色体的最早雏形，它使得DNA 的大片段克隆成为可能，后来为人类基因 组测序工作立下了汗马功劳。
端 粒----稳定线性染色体的末端结构
1978年，Elizabeth Blackburn利用四膜虫纯化 了rDNA,以rDNA为模板通 过体外合成掺入dNTP的实 验，推断出四膜虫的染色体 上有由许多重复的5’CCCCAA-3’六碱基序列组 成的特殊结构区域，此区域 即端粒。
人工染色体
1980年，Elizabeth Blackburn在会议上对这一 重大发现的报告,引起了Jack Szostak的极大兴趣。 他那时候正试图在酿酒酵母 中构建人工线性染色体，让 它能够在细胞中像自然染色 体一样复制。但当环状质粒 线性化并转入细胞后，很快 就被降解掉。
【精品文档】端粒和端粒酶
Assumptions
1.复制前联体、环化（linear→circle） 2.发卡结构 3.可变末端（alterable terminal）多个短重复序列
(short repetitive sequences) 4.蛋白质干预
Puzzleswenku.baidu.com2
1939年,潜心玉米遗传性状研究的 Barbara McClintock (因发现玉米的转座子获诺贝尔学奖)注意 到:在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新 融合起来形成“桥”,在紧接着的有丝分裂中,这种染色 体“断裂---融合---桥---断裂”的循环不断继续。
Jack Szostak
Elizabeth Blackburn
四膜虫
人工染色体
四膜虫
四膜虫是一种特殊的模式生物， 有两个细胞核。小核很稳定，含 5对染色体，用于生殖传代；而 大核在接合细胞的发育过程中， 染色体可断裂成200—300个小 染色体，端粒非常丰富。
Elizabeth Blackburn
D
端粒酶活性的发现
Liz女士的实验室在研究四膜虫端粒序列的过程中还发现 了一个有趣的现象:带着四膜虫端粒DNA的人工染色体 导入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端 粒序列.
由于端粒是由重复序列组成的,当时人们普遍猜想同源重 组是延伸端粒补偿染色体末端隐缩的机制.但是同源重 组只能复制出更多本身的序列,为什么在四膜虫端粒上 加的是酵母的端粒序列而不是四膜虫本身的序列呢?这 个现象是同源重组无力解释的.
端粒酶催化亚基
端粒酶既然能够利用RNA模板亚 基来复制DNA,那么很容易推测 这个蛋白亚基可能具有RNA dependent DNA polymerase 活性(依赖于RNA的DNA聚合酶 活性),即逆转录酶活性.更进一步 说,它的蛋白质序列里应该包含逆 转录酶特有的结构区域.
Nobel Prize in Medicine Awarded for Creaking DNA Puzzle
端粒酶亚基
Liz实验室与Tom Cech合作,对端粒酶活性进一步定性. 用RNA酶处理样品,降解样品的RNA→酶活性消失 用蛋白酶消化→酶活性消失
端粒酶RNA亚基的发现
RNA亚基有一段RNA序列正好和四膜虫的端粒DNA序 列互补,端粒酶正式利用RNA亚基的这段序列作为模板 重复复制出端粒DNA
Assumptions
染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末 端,它有一个特殊的结构来避免染色体之间的相 互融合.
科学家Hermann Muller将这种特殊结构命名 为端粒(Telomere,在希腊语中,telos表示末 端,meros表示片段).
Experiments
Def. 存在于染色体末端的一段 特殊的DNA重复序列
端粒和端粒结合蛋白组成核蛋 白复合物，广泛存在于真核生 物细胞中；
不同种类细胞的端粒重复单位 不同，大多长约5—8bp;
端粒的结构与功能具有保守性.
端粒的功能
保护染色体 末端
A
B
防止染色体 复制时丢失
决定细胞寿 命
C
E
TPE效应
固定染色体 位置
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
这种酶活性不依赖于DNA模板,只 对四膜虫和酵母的端粒DNA进行 延伸,而对随即序列的DNA底物不 延伸;并且该活性不依赖于DNA聚 合酶.
而同源重组对序列没有特异性要求, 并且依赖于DNA聚合酶的活性.
至此,她们澄清了这两种假说,证明 了有一种酶来延伸端粒DNA,即端 粒酶(telomerase)
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
四膜虫在接合细胞的大核发育过程中,大核产生了 非常丰富的小染色体,每一个小染色体都在末端 加上了端粒,可以推测:如果“酶”的假说成立,此 时细胞内的酶活性应该是非常高的.
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温 育,试图在体外检测到这个酶的活性,看到端粒 的延伸.
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
经过不断优化条件,尤其是把底物换成体外合成的高浓度 的端粒DNA后,Carol通过曝光x光片,清楚地看到了“酶” 的活性:在测序胶的同位素曝光片上,端粒底物明显被重 新加上了DNA碱基,而且每六个碱基形成一条很深的带, 与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合.
端粒酶RNA亚基的发现
Daniel Gottschling利用TPE效应设计出实验,筛选酵母RNA亚基 基因: 把URA和ADE连个基因通过遗传重组的方法置入端粒区域,由于 TPE效应,URA和ADE不表达. 酵母只能在含有uracil的培养基中生长,且克隆是红色的.
再转入cDNA表达库,某些调控端粒长度的基因通过过表达可以改 变端粒的长度.如果端粒长度变得足够短,TPE效应就会消失,URA 和ADE两个基因就会启动表达. 这种短端粒的酵母能够在不含有uracil的培养基中生长,并且酵母克 隆显示出白色
人工染色体
端粒序列的发现使Jack Szostak有机会把 线性质粒末端连接到四膜虫的端粒DNA ， 然后再倒入酵母细胞中。奇迹发生了：线 性质粒不再被降解，而是在细胞内稳定存 在并复制。 这是人工染色体的最早雏形，它使得DNA 的大片段克隆成为可能，后来为人类基因 组测序工作立下了汗马功劳。
端 粒----稳定线性染色体的末端结构
1978年，Elizabeth Blackburn利用四膜虫纯化 了rDNA,以rDNA为模板通 过体外合成掺入dNTP的实 验，推断出四膜虫的染色体 上有由许多重复的5’CCCCAA-3’六碱基序列组 成的特殊结构区域，此区域 即端粒。
人工染色体
1980年，Elizabeth Blackburn在会议上对这一 重大发现的报告,引起了Jack Szostak的极大兴趣。 他那时候正试图在酿酒酵母 中构建人工线性染色体，让 它能够在细胞中像自然染色 体一样复制。但当环状质粒 线性化并转入细胞后，很快 就被降解掉。
【精品文档】端粒和端粒酶
Assumptions
1.复制前联体、环化（linear→circle） 2.发卡结构 3.可变末端（alterable terminal）多个短重复序列
(short repetitive sequences) 4.蛋白质干预
Puzzleswenku.baidu.com2
1939年,潜心玉米遗传性状研究的 Barbara McClintock (因发现玉米的转座子获诺贝尔学奖)注意 到:在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新 融合起来形成“桥”,在紧接着的有丝分裂中,这种染色 体“断裂---融合---桥---断裂”的循环不断继续。
Jack Szostak
Elizabeth Blackburn
四膜虫
人工染色体
四膜虫
四膜虫是一种特殊的模式生物， 有两个细胞核。小核很稳定，含 5对染色体，用于生殖传代；而 大核在接合细胞的发育过程中， 染色体可断裂成200—300个小 染色体，端粒非常丰富。
Elizabeth Blackburn
D
端粒酶活性的发现
Liz女士的实验室在研究四膜虫端粒序列的过程中还发现 了一个有趣的现象:带着四膜虫端粒DNA的人工染色体 导入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端 粒序列.
由于端粒是由重复序列组成的,当时人们普遍猜想同源重 组是延伸端粒补偿染色体末端隐缩的机制.但是同源重 组只能复制出更多本身的序列,为什么在四膜虫端粒上 加的是酵母的端粒序列而不是四膜虫本身的序列呢?这 个现象是同源重组无力解释的.
端粒酶催化亚基
端粒酶既然能够利用RNA模板亚 基来复制DNA,那么很容易推测 这个蛋白亚基可能具有RNA dependent DNA polymerase 活性(依赖于RNA的DNA聚合酶 活性),即逆转录酶活性.更进一步 说,它的蛋白质序列里应该包含逆 转录酶特有的结构区域.
Nobel Prize in Medicine Awarded for Creaking DNA Puzzle
端粒酶亚基
Liz实验室与Tom Cech合作,对端粒酶活性进一步定性. 用RNA酶处理样品,降解样品的RNA→酶活性消失 用蛋白酶消化→酶活性消失
端粒酶RNA亚基的发现
RNA亚基有一段RNA序列正好和四膜虫的端粒DNA序 列互补,端粒酶正式利用RNA亚基的这段序列作为模板 重复复制出端粒DNA