基因探针-分子杂交技术
DNA分子杂交技术及其原理
什么是DNA分子杂交技术？给你做个比喻，希望对你理解有帮助。
将宿主DNA（一般做克隆是有很多宿主DNA）比喻成很多还没装锁的“门”，而你希望插入宿主DNA上（或替换掉一段序列）的目的基因比做是一把特定的“锁”，而这个基因探针就是能开那把锁唯一的“钥匙”。
如果你能用“钥匙”打开某个“门”，说明“锁”已经装上了。
也就是说如果能检测到杂交信号，说明目的基因已经接到宿主DNA上了。
杂交的原理其实就是碱基互补配对。
至于怎么看出来是否杂交上，这个是要在探针上做标记（标记可以有很多种，生物的、荧光的、放射性的等等），杂交后是要洗脱的，只有这种特异性的杂交才被保留下来，再通过检测探针上的标记来看出是否杂交上。
比如上面的“钥匙”，就像你用一串的“钥匙”去试，但你可以先在要的那个“钥匙”上做个标记，你不要认识“钥匙”的齿（这里的齿你可以想像成探针的序列），只要认识“钥匙”上的标记就行。
（这个比喻有点漏洞，就是原始的那些“门”不管用不用钥匙都不能打开，但我暂时没想到其它比方）什么是DNA分子杂交原理？DNA分子杂交：DNA分子杂交的基础是，具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。
在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子分离成为单链，这个过程称为变性。
然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。
如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。
由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。
DNA分子杂交的意义：分类学上不同物种的DNA分子之间可以进行分子杂交，但是，远缘物种的DNA分子之间进行杂交分子的可能性远比近缘物种的要小得多。
例如，细菌与真核细胞DNA分子之间形成杂交分子的可能性很小；不同细菌的DNA分子之间杂交时，能形成某些互补片段；人的DNA分子与小鼠的DNA分子之间杂交时，只有少量的人DNA单链和小鼠DNA单链能形成杂交分子，而且只是部分碱基配对。
dna分子杂交技术原理
dna分子杂交技术原理
DNA分子杂交技术是一种常用的实验技术，用于检测、分离
和定量DNA序列。
其原理基于DNA的互补配对特性。
首先，人工合成两条DNA片段，一条称为“探针”，另一条称
为“目标DNA”。
探针和目标DNA片段的序列需要在一定程度上互补。
探针通常被标记上荧光染料或放射性同位素等化学标记物，以便于检测。
然后，将探针和目标DNA混合，并进行热变性处理。
这个过
程使得DNA分子的双链断裂，形成两条单链DNA。
接下来，通过降温使两条单链DNA重新互补配对。
如果目标DNA中
有与探针互补的序列，它们将形成稳定的双链结构。
在杂交后，通过适当的处理，可以将未与探针结合的目标
DNA从混合物中去除。
而与探针结合的DNA可以被检测、定量和分离。
可以使用不同的技术来检测已标记的探针，例如荧光检测或放射性测量。
DNA分子杂交技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、基因
工程和临床诊断等领域。
它可以用于检测特定的DNA序列、
基因分型、基因突变等。
此外，通过结合其他的分析技术，如聚合酶链式反应（PCR），DNA分子杂交技术还可以实现高
效的基因扩增和检测。
dna分子杂交技术操作流程
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[说明]核酸分子杂交及PCR技术
![[说明]核酸分子杂交及PCR技术](https://img.taocdn.com/s3/m/cd08778f50e79b89680203d8ce2f0066f53364c4.png)
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
分子诊断学之核酸分子杂交技术-医学检验
» 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未 知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合 ，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置 或大小显示出来。
» 探针( probe )
带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 Institute of Genetic Engineering
分子克隆基本过程：
切 转
分 切 接
筛
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
分子诊断学
核酸分子杂交技术
Nucleic Acid Hybridization Technology
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
影响复性速度的因素：
DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度
Institute of Genetic Engin1e7ering
二、核酸分子杂交的技术原理
在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中， 或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在 不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
检测对象: 克隆化的基因组DNA，细胞总DNA、总RNA
。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细 胞内杂交, 即细胞原位杂交。
核酸分子杂交特点：高度的灵敏性、特异性
应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特
核酸分子杂交过程
核酸分子杂交过程
核酸分子杂交是一种利用两个不同的核酸分子来检测特定基因的技术。
它通过将一个核酸分子 (称为探针) 与另一个核酸分子 (称为模板) 进行杂交来寻找特定的序列。
杂交过程通常需要高温条件来分解核酸分子的二聚体，并使探针与模板结合。
如果探针与模板匹配，则可以使用特定的技术来检测杂交产物。
常见的技术包括 Southern blotting 和 PCR (聚合酶链反应)。
在 Southern blotting 技术中，模板核酸分子被限制性酶切割后，将其电泳分离，然后将其转移到一种特定的膜上，接着用探针核酸进行杂交，再用特定的方法来检测杂交产物。
在 PCR 技术中，模板核酸分子被加热以分解二聚体，然后用特定的引物进行扩增。
这种扩增过程重复进行多次，直到产生足够的样本量。
这种方法能够在短时间内增加核酸分子的数量，因此适用于病毒、细菌和其他微生物的检测。
核酸分子杂交是一种非常重要的生物技术，广泛应用于医学诊断、基因研究、食品安全等领域。
分子杂交技术
分子杂交技术引言分子杂交技术是一种重要的实验手段，在生物学和生物化学领域被广泛应用。
它通过将两个不同源的核酸序列（DNA或RNA）进行杂交，从而得到具有特定性质和功能的新分子。
在本文中，我们将介绍分子杂交技术的原理、应用和未来发展方向。
原理分子杂交技术主要基于核酸的互补配对原理。
DNA和RNA 分子中的碱基有互补配对性质，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）互补配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）互补配对。
在杂交过程中，两个互补的核酸序列会通过碱基间的氢键相互结合，形成一个稳定的双链结构。
应用分子克隆分子杂交技术在分子克隆中起到至关重要的作用。
通过将目标基因的DNA序列与载体DNA进行杂交，可以实现基因的定向克隆。
例如，使用限制性内切酶将目标基因和载体DNA切割开后，通过杂交技术将两者粘合在一起，形成重组DNA，然后可以通过转化、转染等手段将重组DNA导入到宿主细胞中，实现基因的表达。
基因探针分子杂交技术也被广泛应用于基因探针的设计和制备。
基因探针是一种用于检测目标基因在细胞或组织中表达情况的分子工具。
通过将特异性的探针与目标基因进行杂交，可以实现对目标基因的检测和定位。
分子杂交技术可以用于制备放射性或非放射性的探针，例如荧光探针或生物素标记的探针，从而实现对目标基因的高灵敏度和高特异性的检测。
基因组分析分子杂交技术还可以用于基因组分析。
例如，通过杂交技术可以将特异性的探针与目标基因组中的特定区域进行杂交，从而实现对基因组的定位和映射。
此外，分子杂交技术还可以用于研究基因组中的DNA重复序列、非编码RNA等。
DNA鉴定分子杂交技术在DNA鉴定领域也有广泛的应用。
例如，通过杂交技术可以将可疑犯罪嫌疑人的DNA样本与现场留下的DNA样本进行比对，以确定是否属于同一人。
此外，分子杂交技术还可以用于亲子鉴定、物种鉴定等。
未来发展方向随着科技的不断发展，分子杂交技术也在不断更新和发展。
未来，我们可以预见以下几个方面的发展：1.高通量分子杂交技术的发展：随着高通量测序技术的发展，分子杂交技术可以与测序技术结合，实现对大规模样本的高效分析，从而推动基因组学、转录组学等领域的研究进展。
分子杂交名词解释生物化学
分子杂交名词解释生物化学
1.分子杂交（molecularhybridization）：指在体外将两个不同种类的核酸（通常是DNA）互相杂交，形成一个新的双链分子，其中每一条链都来自于不同的原始分子。
2. 探针（probe）：一种标记有特定序列的核酸分子，用于检测样品中是否存在相同或相似的序列。
3. 单链构象（single-stranded conformation）：指单链DNA或RNA分子在特定条件下所呈现的空间结构，可用于分析核酸序列的变异或突变。
4. 限制性内切酶（restriction endonuclease）：一种具有切割特定DNA序列能力的酶，常用于制备DNA片段或检测特定序列。
5. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：一种通过模拟生物体内的DNA复制过程，在体外扩增DNA序列的技术。
可用于检测或分析极微量的DNA样品。
6. 荧光素酶（luciferase）：一种常用于检测生物体内基因表达水平的标记酶。
常与荧光素底物配合使用，通过检测底物发光信号来表征目标基因的表达程度。
7. 反向转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）：一种将RNA转录为cDNA，再通过PCR扩增cDNA的技术。
常用于研究基因表达调控机制。
以上是分子杂交在生物化学领域中的相关概念和术语，相信可以帮助读者更好地了解和应用分子杂交技术。
分子杂交技术
分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。
该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。
根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。
探针必须经过标记，以便示踪和检测。
使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。
下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。
同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。
近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。
本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。
一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。
它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。
这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。
正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。
因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。
二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。
再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。
医学分子生物学原理-分子杂交和印迹技术
2020年3月4日1时8分
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DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链DNA上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外 切 核 酸 酶活性。
➢ 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。
2020年3月4日1时8分
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核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作 （4）基因突变分析 （5）疾病的诊断
2020年3月4日1时8分
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二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列
的DNA或RNA的互补标记片段：
5′ 3′ 5′
3′
53′′ 5′
3′
2020年3月4日1时8分
3′ 5′ 限制性内切酶
3′ 5′
Klenow DNA聚合酶
完整双链DNA
5 ′末端突出 的DNA
[α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP
变性
35 ′′
3 ′末端标记的 DNA
3 ′ 32P-末端标记的
5′
单链DNA探针
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标记探针的纯化
Luminol化学发光原理
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
思考题：
2020年3月4日1时8分
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核酸分子杂交(DNADNA or DNARNA)
优点：简单、快速、可同时检测多个样品
液相杂交
指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补 的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。
（一）RNA酶保护分析法
1、RNA酶保护分析法原理
RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单 链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成 的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶 保护分析法。
核酸分子杂交的基本原理
DNA变性
• 方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
• 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度(melting temperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)
• DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用， 将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡 核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法 相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针， 而此法则是利用离心的方式来纯化探针
Biotin
Avidin
(2)探针标记物 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
BCIP/NBT
紫蓝色沉淀
碱性磷酸酶
抗Dig抗体 Dig
(3)探针标记方法
影响杂交的因素
核酸分子的浓度和长度
• 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交固相杂交（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交（dot hybridization）是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。
该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
印迹杂交（blotting hybridization）Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。
可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。
Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。
核酸分子杂交的原理和实验方法
核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。
敏感性很高。
可用于膜上杂交和原位杂交。
操作程序(1) 随机引物标记操作程序如下：①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。
②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。
然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。
④置37℃反应至少120分钟。
时间越长，产量越高。
延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。
应根据需要控制反应时间。
⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。
且可反复使用。
可根据下表估计标记产量：DNA模板量标记一小时标记二十小时10ng 45ng 600ng30ng 130ng 1050ng100ng 270ng 1500ng300ng 450ng 2000ng1000ng 850ng 2300ng3000ng 1350ng 2650ng(2)核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。
两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。
核酸分子杂交技术名词解释
核酸分子杂交技术名词解释1. 嘿,各位生物小伙伴们!今天咱们来聊一个特别有意思的技术 - 核酸分子杂交。
听着挺高大上的是不是?别担心,我用最接地气的方式给大家讲明白!2. 核酸分子杂交说白了就是让两条单链核酸配对在一起。
就像是在玩一个超级精密的拼图游戏,每个碎片都得完美匹配才行。
3. 这项技术的原理特别有意思。
你想啊,咱们的脱氧核糖核酸就是大家常说的遗传物质平时都是双螺旋结构,就像一个扭起来的麻花。
要想让它们杂交,得先把这个麻花给拆开。
4. 怎么拆呢?那就得用高温啦!就像煮面条一样,把温度调到九十多度,这些双链核酸就会乖乖分开,变成单链。
这个过程科学家们管它叫变性,我觉得叫"解放单身"更形象。
5. 单链出来后,咱们就把温度降下来,让它们有机会相遇。
这时候有意思的事情就发生了 - 互补的碱基会自动配对,就像是命中注定的情侣相遇一样,立马就黏在一起了!6. 这个配对可有讲究了,得严格按照配对规则来。
腺嘌呤只能和胸腺嘧啶配对,鸟嘌呤只能和胞嘧啶配对。
这就像是相亲一样,条件得完全匹配才行。
7. 杂交技术最神奇的地方在于它的专一性。
要是序列不完全匹配,打死也不会结合。
就像挑食的孩子,一点不对付的东西都不吃。
这种死心眼的性格在这儿反倒成了优点!8. 这项技术在实验室里可有用了。
比如说要找某个特定的基因,就可以设计一个带标记的探针,就像派出一个特务去打探情报。
只要目标序列在,探针就能找到它并紧紧抱住。
9. 在医学检验中,核酸杂交简直就是神探!能查出各种病毒感染,还能诊断遗传病。
就像是给基因做体检,有啥问题一查就知道。
10. 不过做杂交实验也挺考验人的耐心。
温度、酸碱度、盐离子浓度都得控制得刚刚好。
要是哪个条件不对,就像给情侣制造了障碍,想配对都配不上。
11. 现在的杂交技术越来越先进了,还能在芯片上进行。
一个小小的芯片上能同时进行成千上万个杂交反应,效率简直比月老牵红线还厉害!12. 说到底,核酸分子杂交就是让互补的核酸序列相遇、相识、相结合的过程。
简述分子杂交技术的一般实验流程
简述分子杂交技术的一般实验流程title: 分子杂交技术的实验流程
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分子杂交技术是一种常用的基因工程技术，可用于研究DNA或RNA 序列相似性和寻找同源基因，广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
下面我们就来简述一下分子杂交技术的一般实验流程。
1、提取RNA/DNA：首先需要从所研究的生物体中提取RNA或DNA，可以用CTAB法、酚-氯仿法、盐法等各种方法进行提取。
这一步是确
保我们得到高质量的RNA/DNA样本。
2、切割DNA/RNA：若是研究DNA，我们需要使用限制性内切酶切
割DNA；若是用RNA做实验，则需要将RNA转录为cDNA，再使用DNA
酶切割。
这一步的目的是将DNA或RNA分成大量不同大小片段，方便
后续操作。
3、膜上杂交：将DNA或RNA片段与检测DNA/RNA杂交。
这一步需
要将DNA或RNA固定在膜上（通常是聚丙烯腈或硝酸纤维素等），再
用检测DNA或RNA分子与固定的DNA或RNA分子进行杂交反应，以寻
找相同的序列。
4、洗膜：反应后用高盐缓冲液和低盐缓冲液交替洗膜，以去除无
法杂交的DNA/RNA分子，保留杂交的分子。
5、探针检测：将探针（单链RNA或DNA）标记为荧光物等，将其与膜上DNA或RNA分子进行杂交，检测所寻找的DNA/RNA序列是否存在。
如果存在，则探针与目标DNA/RNA分子杂交结合并发出信号，证明样本中有这一特定的序列存在。
综上，这是分子杂交技术的一般实验流程，不同的实验目的会增加一些额外的步骤或调整实验参数。
因此实验过程中要特别注意各操作的条件和细节，以保证实验结果的真实性和可靠性。
分子杂交实验
分⼦杂交实验分⼦杂交实验不同的DNA ⽚段之间，DNA ⽚段与RNA ⽚段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。
这种按照互补碱基配对⽽使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分⼦杂交。
基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋⽚段。
这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进⾏，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分⼦。
分⼦杂交是通过配对碱基对之间的⾮共价键（主要是氢键）结合，从⽽形成稳定的双链区。
杂交分⼦的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有⼀定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
分⼦杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的⼆条单链之间进⾏。
由于DNA⼀般都以双链形式存在，因此在进⾏分⼦杂交时，应先将双链DNA分⼦解聚成为单链，这⼀过程称为变性，⼀般通过加热或提⾼pH值来实现。
⽤分⼦杂交进⾏定性或定量分析的最有效⽅法是将⼀种核酸单链⽤同位素或⾮同位素标记成为探针，再与另⼀种核酸单链进⾏分⼦杂交。
以下是⼏种常见的杂交技术：固相杂交将参加反应的⼀条核酸链先固定在固体⽀持物上，⼀条反应核酸游离在溶液中。
固体⽀持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。
由于固相杂交后，未杂交的游离⽚段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防⽌靶DNA⾃我复性等优点，所以最为常⽤。
常⽤的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern 印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹⼼杂交等。
液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，⼀种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年⾥虽有时被应⽤，但总不如固相杂交那样普遍。
主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较⾼。
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基因探针 ——分子杂交技术
基因探针
❖ 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。
分子杂交技术的分类
❖ 根据其检测对象不同，可分为
Southern杂交 Northern杂交 Western杂交
Southern杂交
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交 检测与分析
检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
地高辛：
可以与dCTP连接成 地高辛-dCTP
原理： 地高辛 +பைடு நூலகம்抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交 ❖ 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂
液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。
❖ 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
Western杂交
❖ 1、基本原理和基本过程与Southern 杂交基本相同
❖ 2、检测对象为蛋白质（或酶） ❖ 3、SDS-PAGE电泳分离 ❖ 4、用“抗体-抗原”免疫反应或
“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。
检测与分析
❖ 1、放射自显影：适用于放 射性同位素标记的探针
❖ 2、比色或化学发光检测： 适于非同位素标记的探针
❖ 通过放射自显影或生化检 测，就可判断滤膜上是否 存在与探针同源的DNA分子 及其分子量。
检测对象 DNA RNA 蛋白质
探针 核酸 核酸 抗体
基本操作程序
印迹
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
转移的方法
❖毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
探针的制备 ❖ 一、探针的合成 ❖ PCR、化学合成等方法 ❖ 二、探针的标记 ❖ 同位素：3H、35S、32P等 ❖ 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等
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电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
Northern杂交
❖ 1、检测对象为RNA。 ❖ 2、与Southern杂交不同的是：1）不需
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱 变性，而是采用化学试剂变性法。 ❖ 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知 的特异mRNA的表达水平，或比较不同组 织或细胞的同一基因的表达情况。