实验二 灭菌、无菌操作技术
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元素），母液2 （微量元素），母液3（铁盐），母液4 （有机物），95%酒精，70％乙醇，0.1％ 氯化汞，洗涤剂，蒸馏水，1mol/L NaOH， 1mol/LHCl，琼脂，蔗糖等。
四、主要实验步骤 1、材料处理及外植体消毒； 室外的叶片→自来水下用软毛刷冲洗干净。如叶片上粘 附许多植物分泌物或其他物质，可以使用洗涤剂（洗衣粉 或洗涤灵）轻轻刷洗，干净为止。 体表灭菌在超净工作台上操作。 紫外照射15～20min→关紫外→工作送风15～20min。 实验台上准备好无菌水，灭菌的三角瓶，灭菌的镊子、刀 片、剪子等，回收氯化汞的容器。 沥干（或者用灭菌的滤纸吸干）植物材料上的水→70％ 乙醇溶液中灭菌15-30sec→无菌水冲洗3次→放入无菌三 角瓶→加入0.1%氯化汞溶液，计时3-6min→无菌水洗涤 6～10次。注意用过的氯化汞溶液以及前3次洗涤植物材料 使用的有污染的水回收到一个的三角瓶中，待处理。
六、注意事项 1、实验安全及实验室使用规则； 2、实验设备使用方法及损坏赔偿条例； 3、本次实验注意事项。 （1）材料消毒要掌握好时间、浓度，避免消毒不够或 过头； （2）酒精用70%-75%效果最好，外植体用酒精消毒时 间一般不超过半分钟； （3）植物激素用过滤灭菌法，不能高温消毒； （4）各种消毒剂处理后，要用无菌水冲洗干净； （5）高温高压灭菌时，注意锅底水位，压力上升至5磅 时要放气，灭菌结束，必须等锅内压力回到零时才能 打开锅盖，灭菌时须有人看守，注意异常情况；
6、整理及清洗； 将污染的培养瓶挑出，灭菌，清洗。 五、作业 1.实验报告（包括实验目的、设备、步骤、结果与 现象分析）； 2.课后思考 （1）什么叫外植体体表灭菌，常用消毒剂有哪些， 各有什么特点，要掌握什么原则？ （2）植物激素一般用什么方法消毒？为什么？ （3）无菌操作要注意哪些问题。 （4）如何区分细菌性污染和真菌性污染？
3、无菌操作及接种； 操作室紫外灯照射20-30min→超净工作台予开 机20-30min→用酒精药棉擦洗手及台面→将酒精 灯点燃，对器具进行烧灼消毒，凉后待用。 将培养瓶在酒精灯火焰区打开盖子，用长镊子将 已消毒的外植体材料接种到培养基中，每管一个茎 段（一张叶片），然后将管口在火焰中烧灼一下， 盖上塞子，扎紧瓶口，做好标记，继续下一个接种。 接种完毕后，将培养材料放入培养室培养。 4、实验完毕，检查仪器（复位），清洗实验器皿， 整理实验台面； 5、污染情况观测； 一星期后，观察是否有细菌或真菌生长，结果记 录，统计污染率。
三、材料、仪器设备及试剂 1.材料 菊花、月季等叶片或带芽茎段。 2.仪器设备 超净工作台，高压灭菌锅，剪刀，解剖 刀，长镊子，PH计或PH 试纸（5.4~7.0）， 电炉或微波炉，酒精灯，培养瓶，烧杯，三 角烧瓶（100 mL），容量瓶（1000mL、 100mL），量筒（1000 mL，100 mL）， 磁力搅拌器，漏斗（6~8cm），移液管（5 mL），吸气球，玻棒，橡皮筋若干，封口 膜，标签纸等。
实验二 灭菌、无菌操作技术
一、实验目的: 了解并掌握植物材料的准备、消毒；培养 基配制及器皿高温灭菌；无菌操作及接种的 原理和技术。
二、原理: 植物组织培养必须在无菌环境中进行， 因此外植体、器皿及作为外植体生长介质的 培养基的灭菌操作非常重要，一旦污染，就 会造成组织培养的失败。野外植物材料都带 有各种菌类，进行离体培养前须经过表面消 毒灭菌；培养基分装封口后应立即灭菌，至 少应在24h内完成灭菌程序。目前广泛使用 的培养基灭菌法是高压蒸汽灭菌；而无菌操 作技术是组织培养的基本技能之一。
2、培养基的配制及培养基和用具消毒； 用量筒或移液器按序分别量（吸）取各种母液，放入 1000 mL烧杯中→加蔗糖30g（按3%）→定容至1000 mL→用1mol/L NaOH和1mol/LHCl调PH至5.8→加7g琼脂 （按0.7%）煮沸至完全融化→用漏斗分装培养基，倒入 100 mL三角瓶中，每瓶30mL→每个三角瓶用封口膜封口， 并作好标记，注明培养基编号等。 高压灭菌，将三角瓶放入高压灭菌锅中，上面覆盖一 层牛皮纸，在温度为121℃，压力为0.105MPa下保持20 分钟。接种所需无菌水、剪刀等也可一起灭菌。灭菌完毕， 高压灭菌锅压力回零，取出三角瓶保持水平，冷却，凝固 后备用。
（6）无菌操作时，操作人员手洗干净，带工作帽、工 作服、穿拖鞋；每次用过器具再次用前都要进行消 毒； （7）操作时尽量在超净工作台的里侧，培养瓶打开盖 时应靠近酒精灯火焰区，瓶口在火焰中烧灼一下， 试管斜拿，开口向上，成45度。接种时镊子尽量不 要接触管内壁，动作要快、沉稳。 （8）在高压蒸汽灭菌过程中，培养基中的某些成分会 发生分解或氧化，常使培养基的PH值发生一定幅度 的变化（PH值常下降约0.1~0.5个单位），PH值变 化的方向及幅度取决于多种因素，如培养基成分、 浓度、灭菌时间温度等，因此在设定培养基PH值时 应根据实际情况参考有关资料或经试验作适当调整。
四、主要实验步骤 1、材料处理及外植体消毒； 室外的叶片→自来水下用软毛刷冲洗干净。如叶片上粘 附许多植物分泌物或其他物质，可以使用洗涤剂（洗衣粉 或洗涤灵）轻轻刷洗，干净为止。 体表灭菌在超净工作台上操作。 紫外照射15～20min→关紫外→工作送风15～20min。 实验台上准备好无菌水，灭菌的三角瓶，灭菌的镊子、刀 片、剪子等，回收氯化汞的容器。 沥干（或者用灭菌的滤纸吸干）植物材料上的水→70％ 乙醇溶液中灭菌15-30sec→无菌水冲洗3次→放入无菌三 角瓶→加入0.1%氯化汞溶液，计时3-6min→无菌水洗涤 6～10次。注意用过的氯化汞溶液以及前3次洗涤植物材料 使用的有污染的水回收到一个的三角瓶中，待处理。
六、注意事项 1、实验安全及实验室使用规则； 2、实验设备使用方法及损坏赔偿条例； 3、本次实验注意事项。 （1）材料消毒要掌握好时间、浓度，避免消毒不够或 过头； （2）酒精用70%-75%效果最好，外植体用酒精消毒时 间一般不超过半分钟； （3）植物激素用过滤灭菌法，不能高温消毒； （4）各种消毒剂处理后，要用无菌水冲洗干净； （5）高温高压灭菌时，注意锅底水位，压力上升至5磅 时要放气，灭菌结束，必须等锅内压力回到零时才能 打开锅盖，灭菌时须有人看守，注意异常情况；
6、整理及清洗； 将污染的培养瓶挑出，灭菌，清洗。 五、作业 1.实验报告（包括实验目的、设备、步骤、结果与 现象分析）； 2.课后思考 （1）什么叫外植体体表灭菌，常用消毒剂有哪些， 各有什么特点，要掌握什么原则？ （2）植物激素一般用什么方法消毒？为什么？ （3）无菌操作要注意哪些问题。 （4）如何区分细菌性污染和真菌性污染？
3、无菌操作及接种； 操作室紫外灯照射20-30min→超净工作台予开 机20-30min→用酒精药棉擦洗手及台面→将酒精 灯点燃，对器具进行烧灼消毒，凉后待用。 将培养瓶在酒精灯火焰区打开盖子，用长镊子将 已消毒的外植体材料接种到培养基中，每管一个茎 段（一张叶片），然后将管口在火焰中烧灼一下， 盖上塞子，扎紧瓶口，做好标记，继续下一个接种。 接种完毕后，将培养材料放入培养室培养。 4、实验完毕，检查仪器（复位），清洗实验器皿， 整理实验台面； 5、污染情况观测； 一星期后，观察是否有细菌或真菌生长，结果记 录，统计污染率。
三、材料、仪器设备及试剂 1.材料 菊花、月季等叶片或带芽茎段。 2.仪器设备 超净工作台，高压灭菌锅，剪刀，解剖 刀，长镊子，PH计或PH 试纸（5.4~7.0）， 电炉或微波炉，酒精灯，培养瓶，烧杯，三 角烧瓶（100 mL），容量瓶（1000mL、 100mL），量筒（1000 mL，100 mL）， 磁力搅拌器，漏斗（6~8cm），移液管（5 mL），吸气球，玻棒，橡皮筋若干，封口 膜，标签纸等。
实验二 灭菌、无菌操作技术
一、实验目的: 了解并掌握植物材料的准备、消毒；培养 基配制及器皿高温灭菌；无菌操作及接种的 原理和技术。
二、原理: 植物组织培养必须在无菌环境中进行， 因此外植体、器皿及作为外植体生长介质的 培养基的灭菌操作非常重要，一旦污染，就 会造成组织培养的失败。野外植物材料都带 有各种菌类，进行离体培养前须经过表面消 毒灭菌；培养基分装封口后应立即灭菌，至 少应在24h内完成灭菌程序。目前广泛使用 的培养基灭菌法是高压蒸汽灭菌；而无菌操 作技术是组织培养的基本技能之一。
2、培养基的配制及培养基和用具消毒； 用量筒或移液器按序分别量（吸）取各种母液，放入 1000 mL烧杯中→加蔗糖30g（按3%）→定容至1000 mL→用1mol/L NaOH和1mol/LHCl调PH至5.8→加7g琼脂 （按0.7%）煮沸至完全融化→用漏斗分装培养基，倒入 100 mL三角瓶中，每瓶30mL→每个三角瓶用封口膜封口， 并作好标记，注明培养基编号等。 高压灭菌，将三角瓶放入高压灭菌锅中，上面覆盖一 层牛皮纸，在温度为121℃，压力为0.105MPa下保持20 分钟。接种所需无菌水、剪刀等也可一起灭菌。灭菌完毕， 高压灭菌锅压力回零，取出三角瓶保持水平，冷却，凝固 后备用。
（6）无菌操作时，操作人员手洗干净，带工作帽、工 作服、穿拖鞋；每次用过器具再次用前都要进行消 毒； （7）操作时尽量在超净工作台的里侧，培养瓶打开盖 时应靠近酒精灯火焰区，瓶口在火焰中烧灼一下， 试管斜拿，开口向上，成45度。接种时镊子尽量不 要接触管内壁，动作要快、沉稳。 （8）在高压蒸汽灭菌过程中，培养基中的某些成分会 发生分解或氧化，常使培养基的PH值发生一定幅度 的变化（PH值常下降约0.1~0.5个单位），PH值变 化的方向及幅度取决于多种因素，如培养基成分、 浓度、灭菌时间温度等，因此在设定培养基PH值时 应根据实际情况参考有关资料或经试验作适当调整。