毛细管等电聚焦电泳(CIEF法)标准操作规程SOP

颁发部门：质量保证部分发部门：分析研究部拷贝号：NO. /

目录

1目的 (4)

2范围 (4)

3定义 (4)

4环境、健康和安全 (4)

5培训 (4)

6职责 (4)

7程序（内容） (4)

7.1原理 (4)

7.2实验材料 (5)

7.3操作步骤 (6)

7.4结果分析 (8)

7.5判定标准 (9)

7.6注意事项 (9)

8相关文件 (9)

9参考文献 (9)

10流程图 (9)

11附录 (9)

毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定记录 (1)

毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定记录（适用于多个样品） (1)

1目的

规范毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）检验的操作过程。

2范围

本规程适用于常规毛细管等电聚焦电泳检验，涉及到蛋白质等电点相关指标的测定。

3定义

3.1CIEF：毛细管等电聚焦电泳。

3.2pI：等电点。

3.3DDI：超纯水。

4环境、健康和安全

4.1乙酸其水溶液呈弱酸性且腐蚀性强，蒸汽对眼和鼻有刺激性作用，因此需适当防护。

4.2氨水具有刺激性气味，易挥发，有毒，对眼、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，能使人窒息。有燃烧爆炸危险。应储存于阴凉、干燥、通风处，远离火种、热源。

5培训

5.1培训部门：分析研究部。

5.2培训对象：分析研究部相关人员。

5.3培训方式和时数：授课，8小时。

5.4考核方式：现场操作。

6职责

6.1质量保证部：负责监督本文件的执行。

6.2分析研究部：负责严格执行本规程规定。

7程序（内容）

7.1原理

两端电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点（pI）时变为中性形式聚焦的区带，而后改变检测器末端电极槽储液的pH值的方法使溶质通过检测器。采集色谱图后，根据各marker pI值与色谱峰的迁移时间的线性关系，从而得到供试品的pI值。

7.2实验材料

7.2.1试药与试液

如无特殊说明，所有试液有效期均为2~8℃，保存3个月。

7.2.2标准物质

7.2.3.1毛细管电泳仪：SCIEX公司PA 800plus或CESI 8000 Plus。

7.2.3.2检测器：紫外检测器，波长280nm。

7.2.3.3毛细管卡盒：适用于7.2.2.1的毛细管电泳仪。

7.2.3.4毛细管：中性涂层毛细管（内径50μm），切割至总长为30.2cm，有效长度为20cm。

7.2.3.5孔塞：孔塞大小2（100μm×200μm）。

7.2.3.6超滤柱：Millipore，货号UFC5010BK。

7.2.3.7其他：样品瓶、蓝色橡胶瓶盖、内插管、移液器、离心机、离心管、超滤柱、量瓶、电子天平、涡旋混合仪。

7.3操作步骤

7.3.1供试品超滤

7.3.1.1取供试品150~350μg加至超滤柱中，再加超纯水定容至500μl，以每分钟不低于13000转离心不少于15分钟。

7.3.1.2弃废液，加超纯水450μl于超滤柱中，以每分钟不低于13000转离心不少于15分钟。

7.3.1.3重复7.3.1.2至少1次。

7.3.1.4取出超滤柱，将其倒转装入一个干净的离心管中，以每分钟不低于3500转离心不少于3分钟收集样品。

7.3.2供试品配制

7.3.2.1样品缓冲液

7.3.2.2各项目所用marker如下：

7.3.2.3取240μl上述样品缓冲液与10μl超滤后供试品混合并充分涡旋混匀30S。将样品移至内插管中，确认内插管下端无气泡后，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中。

7.3.3缓冲液瓶的准备

7.3.3.1在每个样品瓶中放入指定的试剂1.5ml，废液瓶中放入0.8ml超纯水，用蓝色橡胶瓶盖盖好。

7.3.3.2根据选用方法按照7.3.5将缓冲液瓶放入缓冲托盘中，再将托盘放入毛细管电泳仪。

7.3.4缓冲瓶的摆放

7.3.4.1乙酸迁移法缓冲液的摆放，如图7.1所示：

图7.1乙酸迁移法缓冲液的摆放图示

①为超纯水、②为阳极缓冲液、③为尿素溶液、④为CIEF Gel、⑤为化学

迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）、⑥为废液、⑦为阴极缓冲液。

7.3.4.2氢氧化铵迁移法的摆放，如图7.2所示：

图7.2氢氧化铵迁移法的摆放图示

①为超纯水、②为阳极缓冲液、③为尿素溶液、④为CIEF Gel、⑤为化学

迁移液（入口缓冲液为0.35mol/L乙酸溶液，出口缓冲液为0.10mol/L氢氧化铵溶液）、⑥为废液、⑦为阴极缓冲液。

7.3.5编辑方法并调用

7.3.5.1毛细管的预处理：CIEF Gel在50psi压力下冲洗5分钟，然后用超纯水在50psi压力下冲洗2分钟，最后用尿素溶液在50psi压力下冲洗5分钟。每次运行前应进行。

7.3.5.2供试品分离方法主要参数

①样品进样：在25psi压力下进样99秒。

②聚焦：25kV下运行5~45分钟。在乙酸迁移法中，聚焦勾选Normal模式；在氢氧化铵法中，聚焦勾选Reverse模式。

③迁移过程：30kV下运行15~45分钟。在乙酸迁移法中，迁移电压勾选Normal 模式；在氢氧化铵法中，迁移电压勾选Reverse模式

④样品室温度：2~8℃。

⑤毛细管温度：18~22℃。

⑥检测器波长：280nm。

7.3.6供试品检测：将供试品位置号编辑入序列表中，输入相应供试品名称与文件名称，并调用相关方法。运行序列开始检测分析。

7.4结果分析