结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展
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结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（5）基因芯片技术
• 将多种探针固定在玻璃等基片上，与待测样本的 DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂 交信号强度而进行大规模遗传差异分析
• 可用于结核菌种鉴定和Mtb耐药基因 • 诊断快速 • 标本中细菌数超过10000个才能呈现杂交阳性反应 • 敏感度低，特异度高
分类：早期中性粒细胞明显增高，恢复期 以淋巴为主
蛋白含量多在1-3g/L 60%以上葡萄糖低于正常
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
3 影像学检查 无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚 及脑结核瘤等多种形式 头CT早期主要为渗出性，可见脑膜强化。 后期主要为阻塞性脑积水 头MRI，较CT敏感，尤其是波及脑膜或脑干 时
诊断有重要意义 • 患者免疫力低下或长期使用免疫抑制剂可出
现假阴性 • 一次检测不能区分急性和既往结核感染
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
2 结核菌素试验
• 是结核病初筛的主要方法之一 • 常用的是芒图（Mantoux）氏法，即将OT或PPD(
纯蛋白衍生物purified protein derivative，PPD）用 无菌生理盐水稀释成不同浓度，取0.1毫升注射于 左前臂掌侧前1/3中央皮内（注意：左手），72（ 48h～96h）小时检查反应情况，应注意局部有无 硬节，不可单独以红晕为标准。 • 阴性反应 :注射部位有针眼大的红点或稍有红肿， 硬节直径小于0.5厘米 • 阳性反应 :注射部位硬节直径在0.5-1.5厘米。 • 强阳性反应 ：注射部位反应较强烈或硬节直径超 过1.5厘米以上 。
种 • 卡介苗抗原和其他细菌有交叉反应，假阳性
率较高
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋 白衍生物、阿拉伯甘露聚糖（LAM）、早期 分泌性抗原靶6（ESAT-6）蛋白抗原b、分 泌蛋白MPT64、Mtb8.4、Mtb8、Mtb16.3 、A60抗原、Ag85复合体、培养滤液蛋白 10（CFP10等
结核性脑膜炎临床和实 验室诊断现状和进展
2020/12/12
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
目前现状
• 全球每年结核病新增900万例，每年有 170万例结核病患者死亡
• 中国有超过450万例结核病患者，居世 界第二
• 截止2011年，耐多药结核病已有31万 例，全世界约有200万人潜伏感染并可 能复发
• 可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏 试验、药物研究
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
1 罗氏（Lownstein-Jenson)培养法 应用最普遍，敏感度约20%，需时4-8周
2 MGIT（mycobateria growth indicator tube) 液体960培养法 近年研究新方法，敏感度约50%，平均 14.4天，最快10天。操作简单、灵敏，全封 闭非侵袭性检测系统防止交叉污染，是目前 结核培养的主要发展方向
• 准确、简便、需时短、耗材少 • 敏感度88.23%，特异度80% • 由于敏感度高，极易污染，会产生假阳性
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（4）线性探针技术
• 运用多重PCR扩增和和反向杂交技术，通 过检测利福平和异烟肼耐药相关基因rpoB 、katC、inhA的突变
• 敏感度94.3%，特异度96.0% • 用于早期耐药结核病的诊断 • 操作复杂，费用昂贵，不易普及
• TBM早期临床表现、脑脊液变化、影像学 均不典型，脑脊液收集有限，Mtb是细胞内 寄生菌，故很多检测TBM的方法敏感度低 、特异度不高、易误诊、漏诊。
• 目前，尚无一种方法可完全解决TBM诊断 的问题
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
一、临床诊断
1 临床表现 头痛、易激惹、呕吐、发热、颈项
）、胶质纤维酸性蛋白、抗凝血酶Ⅲ可特异 性升高，载脂蛋白E以及A-I、甲状腺素运载 蛋白可特异性降低 • ALOX-5可作为诊断TBM的标志性蛋白，如 与质谱分析联合使用，可提高检出率
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
四、免疫学检测
1 脑脊液结核抗体 • 血清中IgG抗体水平与病变程度呈正相关 • 检测血清中IgG抗体水平对于活动性疾病的
• 检测方法：凝聚试验、酶联免疫吸附试验、 免疫斑点法和免疫金标技术
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 对阿拉伯甘露聚糖（LAM）的检测已 经进入临床诊断，有特异的LAM-IgG 试剂盒，称作结明试验。操作简便， 20分钟可出结果
• 不但可用来诊断TBM，还可以区分潜 伏感染、现症感染、感染Mtb的毒力
• 改良抗酸染色法：通过玻片离心法保留细胞 的完整性，在萋尼染色同时使用去垢剂 Triton，提高细胞通透性，从而显著提高细 胞内外Mtb检出率，敏感度更高
• 仅需0.5ml脑脊液，操作简便易行， • 对形态多变、细胞壁部分或完全缺失的L型
Mtb无法着色 • 不能区分Mtb和非Mtb
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
强直、癫痫、局部神经损害表现、意 识改变、昏睡
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
2 脑脊液 约1/3不典型 多数压力高，达200-400mmH2O 无色透明，浑浊或出现薄膜已不常见；细 胞数多在50-500×10-6/L,也可显著增高（＞ 1000×10-6/L）的患者脑脊液中可检测到抗 酸杆菌
• 阳性反应：机体对结核杆菌有变态反应，过 去曾感染过结核，但不表示有病
• 强阳性反应：可能有活动性感染，应进一步 检查是否有结核病
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/12/12
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
通过连续检测接种标本培养基所显示的荧 光强度变化来判断是否有分枝杆菌生长
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
三、病原学间接检查
• 检测Mtb特异核酸片段或抗原成分 • 有助于结核病诊断和对Mtb分型 • 快速、高效，可发展成为全自动化检
测手段 • 目前诊断TBM领域发展最快的方向。
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 诊断由是否为结核分枝杆菌上升到鉴 别是否为耐药或潜伏感染的问题
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
Fra Baidu bibliotek
• 结核性脑膜炎（TBM）是由结核分枝杆菌 （Mtb）感染引起的非化脓性细菌性脑膜炎
• 在肺外结核中诊断难度、病死率、致死率均 最高
• 同龄阶段结核病患者中儿童TBM占20-45% ，成人只占2.9-5.9%
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
二、病原学检查
• 分为直接病原学检查和间接病原学检 查
• 最新国际TBM诊断标准：脑脊液中镜 检到抗酸杆菌、分离培养到Mtb或 PCR法检测到Mtb，可确诊
• TBM患者脑脊液Mtb载量较低、敏感 度明显低于颅外结核，尤其是肺结核
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（2）胞内结核抗原
• Mtb是胞内寄生菌 • 使用免疫细胞化学法检测脑脊液细胞内的结
核特异性抗原与脑脊液循环结核抗原检测相 比，敏感度可高达72.5-100.0%，特异度达 90.7%
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（3）二维胶内差异凝胶电泳
• 已广泛应用于各种神经系统疾病 • 可鉴别出TBM脑脊液中表达的特异性蛋白 • Mtb蛋白花生四烯酸-5-脂氧合酶（ALOX-5
发光二极管荧光显微镜（LED-FM）观 察“0”-罗丹明染色
• 较普通显微镜放大2-4倍 • 不需油镜 • 可显著提高检测涂片时间，敏感度更高 • WHO建议取代传统的萋尼染色法，是抗酸
杆菌研究的发展方向 • 费用昂贵，目前只在发达国家普遍使用
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
Mtb培养
• 诊断结核病的金标准
• 阴性：无硬结或硬结平均直径<5mm者 • 阳性：硬结平均直径在5-9mm • 强阳性：硬结平均直径在20mm以上，局部有水泡，出血、
坏死及淋巴管炎者
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 阴性反应：无结核菌感染，但应考虑以下情 况：（1）如受试者处于原发感染早期，尚 未产生变态反应（2）正患严重结核病，机 体已丧失反应能力（3）受试者正患其他传 染病，在此类情况下，均可暂时出现阴性反 应
（一）核酸检测
1聚合酶链反应（ PCR）
• 多用于实验研究，非临床诊断 • 最新制定的TBM临床诊断标准将商业化的
PCR检测试剂盒作为TBM诊断的金标准 • 成本高，敏感度低，尚未作为TBM的常规
检查
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（1）经典PCR检测
• 选择性的扩增脑脊液中Mtb的DNA片段 • 常用的靶基因有IS6100保守片段、MPB64
1 抗酸杆菌涂片、染色、镜检
• 直接涂片法 • 离心浓缩法 • 漂浮集菌涂片法
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
萋尼染色法（Ziehl-Neelsen stain)
• 传统方法、应用最普遍、敏感度低
• 只有脑脊液Mtb数量超过1000×10-6/L 时才能检测到
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 敏感度92%，特异度99.6%，2小时可检测8个样本 • 操作安全，方法简便，样品使用量小 • 可用于脑脊液、胸腔积液、腹水、脓、粪便标本中
的MTB检测 • 欧美国家已普遍受到认可
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（3）环介导等温扩增法
• 对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利 用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催 化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门 的浊度仪进行定时定量检测。
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
将特异度高的DNA探针与敏感度高 的PCR技术结合，是结核病研究和临 床应用的一种良好途径
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
2 抗原检测
（1）脑脊液结核抗原 • 不同种类的结核抗原纯度和活性差异很大，
因此，检测效果差异较大 • 截至目前，人们使用过的结核抗原有20余
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
我国从人型结核菌制成PPD（PPD-C），又从卡介苗制成 BCG-PPD，0.1ml为5IU，用于临床诊断 BCG最早由法国科学家卡尔梅特(Calmette)和介朗(Guérin)研制 成功的疫苗，即将有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油胆汁马铃 薯培养基上长期培养传代，得到减毒菌株
抗原、相对分子质量65000蛋白等 • 所需脑脊液量少，敏感度48-100%，特异度
84-98% • 各实验室所用的靶基因、引物、反应条件、
报道的敏感度和特异度差异较大，因此，难 以对TBM的诊断效率进行整体评估
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（2）GeneXpert:
• 通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关 81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR 反应设计和全自动样品处理纯化核酸
（5）基因芯片技术
• 将多种探针固定在玻璃等基片上，与待测样本的 DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂 交信号强度而进行大规模遗传差异分析
• 可用于结核菌种鉴定和Mtb耐药基因 • 诊断快速 • 标本中细菌数超过10000个才能呈现杂交阳性反应 • 敏感度低，特异度高
分类：早期中性粒细胞明显增高，恢复期 以淋巴为主
蛋白含量多在1-3g/L 60%以上葡萄糖低于正常
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
3 影像学检查 无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚 及脑结核瘤等多种形式 头CT早期主要为渗出性，可见脑膜强化。 后期主要为阻塞性脑积水 头MRI，较CT敏感，尤其是波及脑膜或脑干 时
诊断有重要意义 • 患者免疫力低下或长期使用免疫抑制剂可出
现假阴性 • 一次检测不能区分急性和既往结核感染
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
2 结核菌素试验
• 是结核病初筛的主要方法之一 • 常用的是芒图（Mantoux）氏法，即将OT或PPD(
纯蛋白衍生物purified protein derivative，PPD）用 无菌生理盐水稀释成不同浓度，取0.1毫升注射于 左前臂掌侧前1/3中央皮内（注意：左手），72（ 48h～96h）小时检查反应情况，应注意局部有无 硬节，不可单独以红晕为标准。 • 阴性反应 :注射部位有针眼大的红点或稍有红肿， 硬节直径小于0.5厘米 • 阳性反应 :注射部位硬节直径在0.5-1.5厘米。 • 强阳性反应 ：注射部位反应较强烈或硬节直径超 过1.5厘米以上 。
种 • 卡介苗抗原和其他细菌有交叉反应，假阳性
率较高
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋 白衍生物、阿拉伯甘露聚糖（LAM）、早期 分泌性抗原靶6（ESAT-6）蛋白抗原b、分 泌蛋白MPT64、Mtb8.4、Mtb8、Mtb16.3 、A60抗原、Ag85复合体、培养滤液蛋白 10（CFP10等
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结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
目前现状
• 全球每年结核病新增900万例，每年有 170万例结核病患者死亡
• 中国有超过450万例结核病患者，居世 界第二
• 截止2011年，耐多药结核病已有31万 例，全世界约有200万人潜伏感染并可 能复发
• 可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏 试验、药物研究
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
1 罗氏（Lownstein-Jenson)培养法 应用最普遍，敏感度约20%，需时4-8周
2 MGIT（mycobateria growth indicator tube) 液体960培养法 近年研究新方法，敏感度约50%，平均 14.4天，最快10天。操作简单、灵敏，全封 闭非侵袭性检测系统防止交叉污染，是目前 结核培养的主要发展方向
• 准确、简便、需时短、耗材少 • 敏感度88.23%，特异度80% • 由于敏感度高，极易污染，会产生假阳性
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（4）线性探针技术
• 运用多重PCR扩增和和反向杂交技术，通 过检测利福平和异烟肼耐药相关基因rpoB 、katC、inhA的突变
• 敏感度94.3%，特异度96.0% • 用于早期耐药结核病的诊断 • 操作复杂，费用昂贵，不易普及
• TBM早期临床表现、脑脊液变化、影像学 均不典型，脑脊液收集有限，Mtb是细胞内 寄生菌，故很多检测TBM的方法敏感度低 、特异度不高、易误诊、漏诊。
• 目前，尚无一种方法可完全解决TBM诊断 的问题
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
一、临床诊断
1 临床表现 头痛、易激惹、呕吐、发热、颈项
）、胶质纤维酸性蛋白、抗凝血酶Ⅲ可特异 性升高，载脂蛋白E以及A-I、甲状腺素运载 蛋白可特异性降低 • ALOX-5可作为诊断TBM的标志性蛋白，如 与质谱分析联合使用，可提高检出率
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
四、免疫学检测
1 脑脊液结核抗体 • 血清中IgG抗体水平与病变程度呈正相关 • 检测血清中IgG抗体水平对于活动性疾病的
• 检测方法：凝聚试验、酶联免疫吸附试验、 免疫斑点法和免疫金标技术
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 对阿拉伯甘露聚糖（LAM）的检测已 经进入临床诊断，有特异的LAM-IgG 试剂盒，称作结明试验。操作简便， 20分钟可出结果
• 不但可用来诊断TBM，还可以区分潜 伏感染、现症感染、感染Mtb的毒力
• 改良抗酸染色法：通过玻片离心法保留细胞 的完整性，在萋尼染色同时使用去垢剂 Triton，提高细胞通透性，从而显著提高细 胞内外Mtb检出率，敏感度更高
• 仅需0.5ml脑脊液，操作简便易行， • 对形态多变、细胞壁部分或完全缺失的L型
Mtb无法着色 • 不能区分Mtb和非Mtb
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
强直、癫痫、局部神经损害表现、意 识改变、昏睡
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
2 脑脊液 约1/3不典型 多数压力高，达200-400mmH2O 无色透明，浑浊或出现薄膜已不常见；细 胞数多在50-500×10-6/L,也可显著增高（＞ 1000×10-6/L）的患者脑脊液中可检测到抗 酸杆菌
• 阳性反应：机体对结核杆菌有变态反应，过 去曾感染过结核，但不表示有病
• 强阳性反应：可能有活动性感染，应进一步 检查是否有结核病
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/12/12
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
通过连续检测接种标本培养基所显示的荧 光强度变化来判断是否有分枝杆菌生长
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
三、病原学间接检查
• 检测Mtb特异核酸片段或抗原成分 • 有助于结核病诊断和对Mtb分型 • 快速、高效，可发展成为全自动化检
测手段 • 目前诊断TBM领域发展最快的方向。
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 诊断由是否为结核分枝杆菌上升到鉴 别是否为耐药或潜伏感染的问题
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
Fra Baidu bibliotek
• 结核性脑膜炎（TBM）是由结核分枝杆菌 （Mtb）感染引起的非化脓性细菌性脑膜炎
• 在肺外结核中诊断难度、病死率、致死率均 最高
• 同龄阶段结核病患者中儿童TBM占20-45% ，成人只占2.9-5.9%
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
二、病原学检查
• 分为直接病原学检查和间接病原学检 查
• 最新国际TBM诊断标准：脑脊液中镜 检到抗酸杆菌、分离培养到Mtb或 PCR法检测到Mtb，可确诊
• TBM患者脑脊液Mtb载量较低、敏感 度明显低于颅外结核，尤其是肺结核
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（2）胞内结核抗原
• Mtb是胞内寄生菌 • 使用免疫细胞化学法检测脑脊液细胞内的结
核特异性抗原与脑脊液循环结核抗原检测相 比，敏感度可高达72.5-100.0%，特异度达 90.7%
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（3）二维胶内差异凝胶电泳
• 已广泛应用于各种神经系统疾病 • 可鉴别出TBM脑脊液中表达的特异性蛋白 • Mtb蛋白花生四烯酸-5-脂氧合酶（ALOX-5
发光二极管荧光显微镜（LED-FM）观 察“0”-罗丹明染色
• 较普通显微镜放大2-4倍 • 不需油镜 • 可显著提高检测涂片时间，敏感度更高 • WHO建议取代传统的萋尼染色法，是抗酸
杆菌研究的发展方向 • 费用昂贵，目前只在发达国家普遍使用
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
Mtb培养
• 诊断结核病的金标准
• 阴性：无硬结或硬结平均直径<5mm者 • 阳性：硬结平均直径在5-9mm • 强阳性：硬结平均直径在20mm以上，局部有水泡，出血、
坏死及淋巴管炎者
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 阴性反应：无结核菌感染，但应考虑以下情 况：（1）如受试者处于原发感染早期，尚 未产生变态反应（2）正患严重结核病，机 体已丧失反应能力（3）受试者正患其他传 染病，在此类情况下，均可暂时出现阴性反 应
（一）核酸检测
1聚合酶链反应（ PCR）
• 多用于实验研究，非临床诊断 • 最新制定的TBM临床诊断标准将商业化的
PCR检测试剂盒作为TBM诊断的金标准 • 成本高，敏感度低，尚未作为TBM的常规
检查
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（1）经典PCR检测
• 选择性的扩增脑脊液中Mtb的DNA片段 • 常用的靶基因有IS6100保守片段、MPB64
1 抗酸杆菌涂片、染色、镜检
• 直接涂片法 • 离心浓缩法 • 漂浮集菌涂片法
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
萋尼染色法（Ziehl-Neelsen stain)
• 传统方法、应用最普遍、敏感度低
• 只有脑脊液Mtb数量超过1000×10-6/L 时才能检测到
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
• 敏感度92%，特异度99.6%，2小时可检测8个样本 • 操作安全，方法简便，样品使用量小 • 可用于脑脊液、胸腔积液、腹水、脓、粪便标本中
的MTB检测 • 欧美国家已普遍受到认可
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（3）环介导等温扩增法
• 对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利 用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催 化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门 的浊度仪进行定时定量检测。
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
将特异度高的DNA探针与敏感度高 的PCR技术结合，是结核病研究和临 床应用的一种良好途径
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
2 抗原检测
（1）脑脊液结核抗原 • 不同种类的结核抗原纯度和活性差异很大，
因此，检测效果差异较大 • 截至目前，人们使用过的结核抗原有20余
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
我国从人型结核菌制成PPD（PPD-C），又从卡介苗制成 BCG-PPD，0.1ml为5IU，用于临床诊断 BCG最早由法国科学家卡尔梅特(Calmette)和介朗(Guérin)研制 成功的疫苗，即将有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油胆汁马铃 薯培养基上长期培养传代，得到减毒菌株
抗原、相对分子质量65000蛋白等 • 所需脑脊液量少，敏感度48-100%，特异度
84-98% • 各实验室所用的靶基因、引物、反应条件、
报道的敏感度和特异度差异较大，因此，难 以对TBM的诊断效率进行整体评估
结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状 和进展
（2）GeneXpert:
• 通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关 81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR 反应设计和全自动样品处理纯化核酸