酵母的高效转化(Clontech)
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酵母的高效转化（Clontech）
1．在YPAD平板上将酵母菌种划线，30℃下培养直至单菌落出现（3天）。
2．将一个单菌落接种到5ml液体YPAD，30℃下250 rpm振荡培养过夜（8–12 hr）。
3．将 5 μl 预培养液接种到装有50 ml YPDA的250 ml 三角瓶中培养，OD600达到0.15-0.3
（16-20hr）。
4．在室温下700g离心5分钟，弃上清，再加入100ml YPDA，然后在30℃下培养直至OD600达到0.4-0.5（3-5hr）。
5．分装到2x50ml无菌离心管，在室温下700g离心5分钟，弃上清，每个离心管加入30ml无菌水悬浮细胞。
6．再离心，弃水，分别把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，并转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。
7．高速离心15秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂。
8．悬浮细胞到最终600μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。
9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。
10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。
11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下：
240μl PEG（50% w/v）
36μl 1.0mol/L 醋酸锂
25μl 单链载体DNA（2.0mg/ml）
50μl 水和质粒DNA（0.1～10μg）
12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。
13．置30℃保温30分钟。
14．置42℃水浴中热激20～25分钟。
15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。
16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。
17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。