酵母重新转化及对照制备

酵母感受态的制备(化学法)

1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

酵母双杂(共转)

酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。

GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。

将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。

说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。

酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。

由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。

除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。

Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。

1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

酵母过程自己总结

一．准备过程(定容均用ddH2O)1，葡萄糖溶液用于给培养基提供碳源40%葡萄糖配100ml，即40g葡萄糖定容于100mlddH2O中。

1L培养基需要50ml葡萄糖溶液（葡萄糖溶液灭菌：115度，15分）2，10*LiAc溶液终浓度为1M用乙酸调PH7.5定容后高压灭菌3.10*TE溶液Tris 终浓度0.1M(Hcl调PH7.5)EDTA-Na 终浓度 0.01M二者混合定容后高压灭菌4.Trp—Leu终浓度8g/L（NaOH调PH6.0-6.5）加入Agar（20g/L）灭菌后倒板前加入灭好的55度预热的葡萄糖溶液5.Tre-Leu-His-Ura+3AT与4步骤相同，另3AT终浓度为25Mm6.x-gal solution溶液（注意现用现配）溶液包括 Z buffer 10ml10mg x-gal 溶于100ulDMF （避光）60ulẞ-巯基乙醇其中Z buffer(100ml装)包括Na2HPO4·12H2O 2.147g NaH2PO4·2H2O 0.591g MgSO4·7H2O 0.0246g Kcl 0.075g7.YPAD培养基1LYest extract 10gPeptone 20gDextrose 20gA 100mgAgar 20g(Hcl调PH6.0)二．酵母感受态的制备(MAV203)1.划板挑菌摇菌，30度，16-18小时后扩摇3-5小时，OD值=0.42.室温离心，5分钟，3000g，去上清3，加入一半量得灭菌水，重悬沉淀，再次离心，条件同上4.再用一半量的1*TE/LiAC,重悬沉淀，离心，条件同上5.后再用少量1*TE/LiAC,重悬沉淀，每管分装40-50ul后待转化另25ml1*TE/LiAC包括2.5ml10*TE2.5ml10*LiAC20mlddH2O（一般扩摇1L MAV203可以制备20管左右的酵母感受态）（注意即做即用）三．转化1.将ssDNA放于沸水中10分钟，后放于冰上5分钟，可重复一遍，使其彻底变性2.将感受态 40-50ulssDNA 5ulBD 1-2ulAD 1-2ul以上四种混合与离心管中，轻弹是其充分混合3．将10*TE 300ul10*LiAC 300ul50%PEG3350 2.4ml以上三种混合，取300ul，加入到2中离心管，震荡混匀10秒4.30度200rpm，摇陪30分钟5.42度水浴热激15分钟后放冰上数分钟6.6000-8000g，20-30秒离心后，去上清。

重组法酵母转基因的操作流程

重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。

一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。

-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。

-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。

-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。

-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。

2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。

-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。

-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。

-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。

3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。

酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。

-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。

-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。

-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。

-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。

-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。

-电泳过程中伴有导入液的减量。

结束电泳时，针尾切割成小片。

-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。

-调整酵母细胞浓度。

-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。

-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。

-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。

-回收转化后的酵母菌体并进行培养。

4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。

-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。

-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。

-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。

酵母转化手册(译自Yeastmaker

clontechclontech提得3x1材料h的readyto供提供预先混习交流不做其transforma方法适用于所常规转化方的转化效率是稀有的相互个特殊又重酵母细胞105转化子uogomediap混合好的培养表1酵母转其他用途如ationsyst所有的酵母方法更为高效是必要的条互作用此方重要的步骤
质粒 DNA（浓度、纯度高）变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B．方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。

酵母菌表面展示实验前的准备工作步骤

酵母菌表面展示实验前的准备工作步骤酵母菌表面展示实验是一种常用的生物技术手段，用于在酵母菌表面展示外源蛋白或多肽，以实现对这些蛋白或多肽功能的研究。

在进行酵母菌表面展示实验之前，需要进行一系列的准备工作，以确保实验能够顺利进行并获得可靠的结果。

准备工作步骤如下：1. 酵母菌培养基的准备：酵母菌培养基是实验所需的基本培养基，可根据实验要求选择不同类型的培养基。

常用的酵母菌培养基包括YPD培养基、SD培养基等。

需要按照配方将培养基的各种成分称量并混合，然后进行高温高压灭菌，最后将培养基倒入适量的培养容器中。

2. 酵母菌培养样品的准备：酵母菌培养样品是实验中需要用到的酵母菌细胞，可以从实验室保存的冷冻细胞中复苏培养得到。

首先需要从冷冻细胞中挖取一小部分并接种到含有适量培养基的琼脂平板上，然后进行恒温培养。

培养过程中，可以观察到酵母菌的生长情况。

3. 酵母菌转化体的制备：酵母菌转化是将外源DNA导入酵母菌细胞内的过程，用于实现酵母菌表面展示。

在实验中，需要首先将目标基因克隆到酵母表达载体上，然后通过化学方法或电穿孔法将酵母表达载体导入酵母菌细胞内。

转化后，通过选择性培养基筛选出转化成功的酵母菌。

4. 酵母菌培养：在进行表面展示实验之前，需要将转化成功的酵母菌培养至适当的阶段。

通常情况下，酵母菌会从初级培养开始逐渐生长，直到达到所需的菌体数量。

在培养过程中，需要定期检测菌株的生长情况，调整培养条件以促进酵母菌的生长。

5. 准备相关试剂和材料：在进行酵母菌表面展示实验前，需要准备实验所需的各种试剂和材料。

例如，可以准备酵母菌培养所需的培养基组分和琼脂平板，准备转化所需的DNA、电穿孔缓冲液等。

此外，还需要准备一些常用的实验设备，如离心机、培养箱等。

6. 实验室卫生和个人防护：在进行酵母菌表面展示实验前，需要确保实验室的卫生状态良好，并采取必要的个人防护措施。

实验室应定期清洁和消毒，实验人员需要佩戴实验手套、实验口罩等个人防护装备，以避免可能的交叉污染和实验安全问题。

酵母感受态细胞的制备及酵母转化

a
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子，用铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上；酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only）加蒸馏水调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。注：如果需要在 YPD(YPDA) 中加抗生素如 kanamycin，在上面准备的培养基中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水浓度为 2％。注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：

酵母转化常用培养基及程序

酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。

2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。

2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。

转化酵母实验报告

一、实验目的1. 掌握酵母转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉酵母转化过程中所使用的试剂和仪器。

3. 通过实验，了解酵母转化实验在基因工程中的应用。

二、实验原理酵母转化是指将外源DNA分子导入酵母细胞内，使其在酵母细胞内表达的过程。

本实验采用化学转化法，利用氯化钙处理酵母细胞，使其成为感受态细胞，从而实现外源DNA的导入。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 酵母菌株：Saccharomyces cerevisiae- 载体质粒：pUC19- 酵母转化试剂盒：S.C. EasyComp Transformation Kit- YPD培养基：酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖- 氯化钙：CaCl2- 甘油：丙三醇- 碘化钾：KI- 磷酸氢二钠：Na2HPO4- 磷酸二氢钠：NaH2PO4- 水合氯醛：CHCl3- 无水乙醇：C2H5OH- 70%乙醇：C2H5OH2. 实验试剂：- 20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于80ml蒸馏水中- 10mg/mL质粒DNA溶液：取适量质粒DNA，加入适量无菌水，配制成10mg/mL 的溶液- Solution I：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠- Solution II：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠和1.0mol/L甘露醇四、实验步骤1. 酵母细胞培养- 将酵母菌株接种于YPD培养基中，于30℃培养过夜。

- 次日，挑取单菌落，接种于50mlYPD培养基中，于30℃、220rpm摇床培养过夜。

2. 酵母细胞感受态制备- 取适量菌液，于4500rpm、室温离心5min，弃上清。

- 加入10ml Solution I，重悬菌体。

- 4500rpm、室温离心5min，弃上清。

- 加入1ml Solution II，重悬菌体。

- 将菌液分装至1.5ml离心管中，每管50μl，于-80℃保存。

3. 酵母转化- 取适量质粒DNA溶液，加入适量无菌水，配制成10ng/μl的溶液。

重组法酵母转基因的原理与操作流程

重组法酵母转基因的原理与操作流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法设计方案一：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。

电转化：1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。

酵母感受态yih制备

酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。

下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。

一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。

二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。

当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。

2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。

3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。

转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。

4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。

三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。

2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。

3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。

4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。

5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。

四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。

2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。

3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。

酵母转化常用培养基及程序

酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。

2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。

2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。

几种酵母转化方法

几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子（Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.电转化注意点：一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。

酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

酵母感受态制备

1，(1)从YPD阴性培养板上挑取单个菌落ppastorisGslls，接种于YPD 2mL培养基中，30℃振荡培养过夜(225r/mln)。

(2)取过夜活化的GS115菌液100微升接种于培养基YPD10mL中，30℃下摇床过夜。

(3)当菌液的OD600为0.8一1.2时，取出，用预冷的无菌水多次洗涤，4℃离心(3000r/mln)5min，最后沉淀以冰冷的lM的D一山梨醇重悬细胞沉淀，4℃离心(3000r/mln)5min(4)该沉淀溶于冰冷的1M的山梨醇200微升，以备转化。

醋酸钠溶液20林L、冰冷的无水乙醇40林L，于一20，r/min)20而n，弃上清，待乙醇挥干后，以nDw(2)将新鲜制备的GS115感受态细胞80微升与质粒10微升充分混匀，转入电转杯，冰浴5Min，1500v，25uf, 250电击。

(3)立即加入冰冷的1mo比山梨醇1ml,，转移入一无菌EB管中，30℃下静置2h,然后从中分别取出20微升，50，100，200微升涂板于含有抗生素的YPDS板上。

(4)30℃避光保存3天后，挑取单克隆至YPD2 ml中，30℃摇床震荡避光培养至对数生长期，冻存。

(4)与此同时，以不含目的基因Tal一TPS的空质粒电转化感受态GS115，操作方法同上。

电转化的单克隆冻存菌10微升经过夜活化后，接种于含有抗生素的YPD培养液2ml中，，30℃振荡避光培养过夜，次日分别于含zcocin高浓(1000ug/mL)的YPDs平板上进行培养，挑取20个单克隆菌落，YPD扩增培养4d。

(3)收集上清500ul，8000r/min离心5min后除去菌体，获得的上清加2倍体积冰冷的无水乙醇，-20℃放置30min，12000r/mln离心5min，弃去上清，获得的沉淀即为浓缩的蛋白。

(4)获得的浓缩蛋白溶于样品缓冲液20ul中，100℃变性3min，并按表2-6进行电泳。

(5)电泳分2个阶段进行，浓缩胶中:电压60V，电流13mA，lh;分离:电压150V，电流20mA，l.5h。

酵母实验方法

酵母实验安排准备工作：1 活化酵母的平板培养基2 摇菌用的液体培养基3 1.5ml离心管，250ml,500ml，1L三角瓶4 去离子水5 TE-LiAC，TE-LiAc-PEG,DMSO,1XTE buffer6 carrierDNA, 目的质粒7 水浴42℃，摇床，离心机等。

酵母转化实验步骤：酵母细胞的准备：1AH109 ，BD-ASR酵母平板划线，活化，30℃培养2-4天2接种1ml培养基到1.5ml离心管中，加入2-4个酵母克隆（选择直径在2-3mm的酵母克隆，培养不超过1周），充分摇晃培养基，直到看不见细胞块存在；3在250ml烧瓶中加入50ml培养基，并加入1ml酵母菌液；30℃，225-250rpm，培养稀释过的菌液18-24h；4检测OD600值，OD600=1.2 ，大于1.2时，加入培养基稀释重摇，小于1.2时，培养1-2h再检测，超过24h仍然小于1.2时，重新摇菌；5在1L的烧瓶中添加300ml培养基，然后吸取50ml的酵母菌液加入，30℃培养3h，225-250rpm；6在1000rpm下离心5min，常温下获取细胞；7除去上清液，用50ml的去离子水重新旋起细胞；8在室温1000rpm离心5min细胞液；9除去上清，并用1.5mlTE-LiAC溶液旋起细胞；感受态细胞的转化：1 carrierDNA 制备，水浴煮沸carrierDNA 20min,迅速放置在冰上冷却；2 将100ul的酵母细胞均匀分在各个离心管中，使用直径较大的离心管；3 在每个离心管中加入100ul carrier DNA；4 在每个离心管中加入100ng的目的质粒，为了双重转化，每种质粒加入200ng,使每管中质粒DNA总量达到400ng；5 加入600ul的TE-LiAc-PEG溶液到每个离心管中，并涡旋混匀；6 在30℃，200rpm，30min培养7 每管中添加70ul的DMSO，慢慢混匀；842℃水浴条件下热激样品10min；9将样品放置在冰上10min ;103000rpm离心样品10s ，收集细胞11用标准移液枪移出离心管中所有上清，如果有必要，可以移出上清后在离心机上离心几秒，移出多余的上清液；12添加0.5ml 1XTE buffer，并涡旋使细胞重悬，如果除去上清时使细胞重悬，则需要用直径较大的枪头，降低吸液的压力。