酵母重新转化及对照制备

酵母重新转化及对照制备(20181213)

背景：

前面酵母转化非常不顺，对照制备失败。这次置换Y2HGold菌株（from陆勇军老师实验室），重新转化相关质粒以及制备酵母筛库的对照。

实验设计：

实验流程：

1.复苏及培养酵母

1)提前三天划板(YPDA无筛选板)复苏酵母细胞Y2HGold、Y187，至30℃恒温培养箱生长3

天

2)将复苏的菌落挑单克隆至3ml YPDA液体培养基(15ml摇菌管) ，至30℃恒温摇床200rpm

摇8h

3)将5ul/10l培养物分别转入2个50mlYPDA液体培养基（250ml锥形瓶）

至30℃恒温摇床200rpm摇16-20h，至OD600=0.15-0.3

4)将培养物转至50ml离心管，室温离心700g 5min

5)弃上清，将沉淀的酵母细胞重悬，转至100mlYPDA液体培养基（250/500锥形瓶）

至30℃恒温摇床200rpm摇3-5h，至OD600=0.4 -0.5

2.制备酵母感受态

6)将上述培养物转至2个50ml离心管，室温离心700g 5min

7)弃上清，悬浮于30ml去离子水中（50ml离心管），室温离心700g 5min

8)弃上清，悬浮于3ml 1.1XTE/LIAC中，分装于两个1.5mlEP管中，每管高速离心15s

9)吸弃上清，把沉淀悬浮于600ul 1.1XTE/LIAC中

3.转化

10)在1.5mlEP管中加入相应质粒1000ng

10)加入5ul Carrier DNA（提前变性处理：95~100℃ 5min，冰上冷却）

11)加入50ul 酵母感受态细胞，温和混匀

12)加入500ul PEG/LIAC，温和混匀

13)放入30℃水浴锅30min 每15min摇一次

14)加入20ul DMSO，温和混匀

15)放入42℃水浴锅30min 每10min摇一次

16)高速离心15s

17)弃上清，加入500ul YPD-plus液体培养基

放至30℃恒温摇床摇90min 100rpm

18)室温离心700g（2500rpm）5min

19)弃上清加入500ul 0.9% NaCl至EP管中

涂板吹干封板

（100ul 1/100稀释液于相应平板上玻璃珠摇匀）

20)放至30℃恒温培养箱生长3天

4.单转→mating

1)分别挑取一个2-3mm的菌落，制备酵母双杂对照

阳性对照：pGBKT7-53 x pGADT7-T

阴性对照：pGBKT7-Lam x pGADT7-T

2)将两种菌落挑入至加了500ul 2xYPDA液体培养基的1.5mlEP管

3)30℃，220rpm，20-24小时

4)100ul 1/10、1/100、1/1000 、1/10000 稀释液涂布于下列平板上：

DDO、QDO/X/A

5)放至30℃恒温培养箱生长3天

6)从DDO平板上挑取2-3mm的健康菌落，在新的DDO板上重新划线

（即得到pGBKT7-53 x pGADT7-T阳性对照克隆）

7)放至30℃恒温培养箱生长3天

8)保存：

短期保存（＜4周）：封口膜封好，4℃储存

长期保存：挑一个大而健康的菌落重悬于500ul YPDA+25%甘油中，-80℃储存