胰脂肪酶

〈一〉概念

1.脂肪酶简介

脂肪酶(1ipase EC 3．1．1．3)全称为甘油三酯基水解酶，是一类特殊的酯基水解酶。其相对分子量在20-100KD变化。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶催化水解反应的特征在于，酶是溶于水的，而底物却不溶于水，因此催化反应只能在油水接触的界面上，是一种专门在异相系统(油—水)界面上水解特殊酯(脂肪酸甘油酯)类的酶。

2.脂肪酶的催化机理

脂肪酶的活性催化部位主要由一个催化三联体(Triad)构成：即组氦酸(His)、色氨酸(ser)和天冬氨酸(Asp)。通常情况下，脂肪酶的活性中心丝氨酸残基的侧链构象空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似．所不同的是脂肪酶的活性中心隐藏在蛋白质内部，而被不同的“盖子”所覆盖。脂肪酶的特殊的结构特点导致其特有的应用价值。脂肪酶区别于其他酯酶主要在于脂肪酶作用于油—水界面，而且表现出特有的界而活性(interracial activation)

3．脂肪酶的几点说明

（1）.脂肪酶是由生物细胞产生的具有催化活性的蛋白质，对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素的变化均有可能导致酶活力的丧失。因此人们普遍采用固定化酶的方法对酶进行修饰，以提高生物酶的经济价值。

(2).在酶蛋白的高级结构中，为了保持氢键、疏水键、离子键等比较弱的键，在固定化时，应避免高温、强酸、强碱处理。此外，有机溶液、浓的盐类有时也会使酶失活，所以应在极其缓和的条件下进行固定化

4.胰脂肪酶

胰脂肪酶是水解膳食脂肪的最重要的酶, 等电点为5.0的酸性蛋白分子。可水解50% ~70%的食物脂肪。通过抑制胰脂肪酶活性可以控制高血脂。猪胰脂肪酶(PPL)分子粒径为4.6×2.6×1.1 nm3 ，固本实验需要合成的介孔材料孔径大小可在7-8nm之间。

〈二〉实验

1..猪胰脂肪酶的固定化方法

吸附法、交联法、包埋法和共价偶联法四种

吸附法：在50 ml带塞锥形瓶中，称取40 mg棒状介孔材料SBA-15，加入2 mg.ml-1的酶液20ml(用缓冲溶液配置)，盖上瓶口以防止挥发。把锥形瓶放入水浴振荡器中，在25 o C以215 r.min-1的速度振荡。固定后的悬浮液置于高速冷冻离心机中，在5 o C下，以6000 r.min-1的速度离心10 min，分离上清液。

用紫外分光光度计270 nm处测量原酶液和上清液的的吸光度，计算酶的吸附固定化量。根据Bradf．ordl67J计算方法，酶的固定量及固定化率可以分

100

P a为固定酶的量，IY％为酶固定化率；c i和C f分别为酶被棒状介孔材料SBA-15吸附前后的酶液的浓度(mg .ml-1)；V为加入酶液的体积(m1)；W为加

入棒状介孔材料SBA-15的量(g)。

2.固定时间对酶固定量和酶活的影响

用0.02 M的磷酸盐缓冲液(pH=7．0)配制2 mg.ml-1的酶液，固定步骤同上。将棒状介孔材料SBA-15和酶液的混合液在水浴振荡器中振荡固定不同的时间，测量固定时间对酶固定量和酶活性的影响。

3.缓冲溶液pH对酶固定量和酶活的影响

将脂肪酶溶于不同pH值的缓冲液中(pH=5.0的缓冲溶液用的是磷酸二氢钠和柠檬酸缓冲溶液，pH=6.0-8.0为磷酸盐的缓冲溶液，pH=9.0—lO.O为碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲溶液)，其余固定步骤同上，测定缓冲溶液pH值对酶固定量和酶活的影响。(没有考虑ph=4.0的情况，是因为SBA-15在该ph下搅拌不稳定)

4.胰脂肪酶酶活性测定

（1）测定原理

脂肪酶在一定条件下，将甘油三酸酯水解，在不同的阶段可释放出脂肪酸、

甘油二酷、甘油单酯及甘油。水解所释放出的脂肪酸可以用标准碱液滴定制，从而计算出脂肪酶的活性。

（2）操作步骤

在锥形瓶中加入2．0 g三乙酸甘油酯、50 g去离子水和25 ml pH=7．0的磷酸盐缓冲溶液，在35 o C水浴中搅拌约20 min，配制乙酸甘油酯乳状液。搅拌速度从最丌始的速度不断增加，直到pH值稳定不变。加入一定量的PPL，用0．02 M的NaOH滴定产生的乙酸，计录前段时问维持pH值不变所消耗的NaOH的体积。从所消耗的NaOH的体积计算自由PPL的活性。空白实验是在

没有加入自由酶或固定酶时所消耗的NaOH的体积。消耗NaOH的体积要除去空白实验所消耗的体积。

固定酶的活性测定方法同上。

U. g-1)按以下公式计算：

上式中：V为酶液样品消耗的0．02 M氢氧化钠毫升数；V0为对照空白样品消耗的O．02 M氢氧化钠毫升数；w为测定时所用酶粉的克数；t为酶催化时间(min)。

3.固定时间对酶固定量和酶活的影响

用0.02 M的磷酸盐缓冲液(pH=7．0)配制2 mg.ml-1的酶液，固定步骤同上。将棒状介孔材料SBA-15和酶液的混合液在水浴振荡器中振荡固定不同的时间，测量固定时间对酶固定量和酶活性的影响。

4.缓冲溶液pH对酶固定量和酶活的影响

将脂肪酶溶于不同pH值的缓冲液中(pH=5.0的缓冲溶液用的是磷酸二氢钠和柠檬酸缓冲溶液，pH=6.0-8.0为磷酸盐的缓冲溶液，pH=9.0—lO.O为碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲溶液)，其余固定步骤同上，测定缓冲溶液pH值对酶固定量和酶活的影响。

<三>存在疑问(请老师帮忙)

1.胰脂肪酶的固定化很多，是否有一定的意义？

2.酶活测定的方法只找到以上一种，是否还有其他更简便的方法？

3.师姐说，她假期做脂肪酶时，很难固定上？