微藻的筛选与培养

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1990
1995
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2005
2010
2015
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什么是微藻？
微藻(Ｍicroalgae)是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富 且光合利用度高的微型自养植物。地球上微藻种类繁多，但 目前被人类发现并利用的种类不多，特别是海洋微藻，目前 开发的更是微乎其微。
Chlorococcum sp. GD的透射电镜照片。（a）营养 细胞。×6，000。（b）细胞壁。×15，000。（c） 细胞核。×15，000。（d）线粒体。×15，000。 （e）油脂颗粒。×15，000。（f）蛋白核。×15， 000。（g）叶绿体，蛋白核。×15，000。（h）高 尔基体，内质网。×15，000。（缩写：CW-细胞 壁；Chle- 叶绿体被膜；Chl-叶绿体片层；S-淀粉颗 粒；m- 线粒体；Ps-蛋白核基质；Ss- 淀粉鞘； Pych-源自叶绿体的穿刺蛋白核的双层膜通道；G高尔基体；N- 细胞核； n-核仁；ER-内质网；LB油滴。）
分子生物学方法：18s rRNA、ITS、rbcL、SSU、psaA基因 序列分析。
生物诱变
重离子束
紫外线
乙基甲磺酸
正向和反向遗传学方法改善微藻特性
Chlorococcum sp. GD 的光学显微镜照片
Chlorococcum sp. GD的扫描电镜照片。（a-b）藻 株群体；（c-d）单个藻株。
光生物反应器(Photobioreactor, PBR)
柱状光生物反应器 平板式光生物反应器 管道式光生物反应器 搅拌型光生物反应器
柱状光生物反应器
柱状光生物反应器主要由透明圆柱罐、气体分布装置、 温度控制装置、光源组成。
4种柱式光生物反应器
平板式光生物反应器
反应器形状多是垂直立方形，户外规模培养时反应 器通常倾斜一定的角度以获得最佳的入射光强度。
封闭式光生物反应器的优缺点
膜式光生物反应器
膜式光生物反应器是利用微藻具有吸附在固体培养 基中形成生物膜的趋势研制出的微藻培养光生物反 应器。
光生物反应器两阶段培养模式
按微藻营养模式分
营养模式 光能自养 Photoautotrophy 混合营养 Mixotrophy
异养 Heterotrophy
Ⅱ、液体低温保种 保种时间为1年；
Ⅲ、液体常温保种 保种时间为3个月。
微藻的培养方式
1、按培养纯度分 2、按培养密闭程度分 3、按微藻营养模式分 4、按进料方式分
按培养纯度分
纯培养：即无菌培养。要求最为严格，生产性培养中 很难做到。
单种培养：指可有细菌存在但只有一种藻类的培养。
混合培养：也称多种培养，是指一培养体系中存在两 种或两种以上的微藻细胞同时生长。
21.617
7
35.300
9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-
12.546
8
35.842
6,9,12-Octadecatrienoic acid
5.199
9
36.464
9,12,15-Octadecatrienoic acid (Z,Z,Z)-
12.717
微藻保藏
Ⅰ、固体平板低温保种 保种时间为2年；
利用废水中的氮、磷等营养元素， 不仅有助于缓解水体富营养化程度 降低废水处理成本，且可大幅降低 微藻生长所需氮源成本及磷源成本。
环境-微藻-能源耦合体系
阳光
废气CO2
生物质
N、P废水
CO2光合作用转换
氧气
以徽藻为原料生产生物柴油的主要技术环节
微藻能源生产技术路线图(产油)
自然筛选、诱变育种或 基因工程手段改造
油脂产率高
微藻热解所得生物质燃油热值高
生长周期短
微藻的生长周期很短(1~10 d)，因此收获周期）也大大短于 传统农作物，可以实现高产量的连续收获，使其产油效率大 大增加。
占地面积少
不与农作物争地(可用滩涂、盐碱地、荒漠等) 、争水(可用 生活污水、海水和盐碱水等 )。
生产成本低
藻类含有较高的脂类、可溶性多糖和蛋白质等易热解的化 学组分，而木材则以木质素、纤维素等难热解成分为主， 因此藻类所需热解条件相对较低，可降低生产成本。同时， 藻类易被粉碎和干燥，因而其预处理成本也较低。
封闭式培养：指单胞藻在一相对封闭的体系中培养， 主要用于科研研究，也用于生产性培养，也有在工厂 化生产中应用。培养体系一般在100 L以下。
优点：不易染菌，可纯培养，生 产效率高，占地面积小，培养密 度高，藻体易于收获，水消耗量 少，可对运行参数进行控制，受 外界自然环境影响小。
缺点：建设费用高，运行费用高， 表面易形成生物膜，清洗困难，需 强化传质、传热及透光，技术先进 但不成熟。
40%
总脂产率 (mg/L*d)
10
Chlorococcum sp.GC脂肪酸组成
N0. Time (min)
Name
Relative amount (%)
1
29.146
Hexadecanoic acid
23.101
2
30.404
7,10-Hexadecadienoic acid
4.971
3
31.909
能源 光照
光照
有机物
碳源 CO2
有机碳和 CO2
有机碳
光能自养培养
在光能自养培养中，微藻利用光照（自然光或人工 光照）和无机物（H2O、无机盐和CO2）进行光合作 用，合成有机物，维持自身生长。由于微藻都可以 进行光合作用，因此光能自养是广泛采用的一种微 藻培养方式。
异养培养
微藻异养培养是指在黑暗条件下微藻利用外加的有 机碳源进行培养。
50倍
微藻光合色素含量占其 干重的2.5%分布于整个 细胞，整个细胞就是一 个光合反应器，有利于
光合产物的合成与转运。
植物光合天线
微藻光合天线
几十倍
植物的捕光天线是类囊体膜 内的叶绿素,而藻类的捕光天 线色素主要集中于紧连在类 囊体膜外的藻胆蛋白内。天 线系统的功能是将所吸收的 光能高效地传递到与之相联 系的光反应中心。
4、比表面积更大
等量
树叶 比表面积:10-3 m2
1 g干 物质
微藻 比表面积:1.3×103 m2
相同质量的微藻比表面积是树叶的1.3×106倍，比表 面积越大，受光面积越大，越有利于光合作用。
5、更高含量的光合作用单位
植物光合色素含量占 其干重约0.05%,分布 于树叶、树干等组织 中细胞的特定部位， 不有利于光合产物的 合成与转运。
6、微藻具有独特的CO2浓缩机制
CCM(CO2-Concentration mechanism)：即 为CO2 浓缩机制。当藻类细胞由高浓度CO2 培养转入低浓度CO2，细胞可不断地从外部 环境中把无机碳或CO2运输到体内，
使体内的CO2 浓度高于外界环境，以有 利于光合作用碳循环第一个关键酶 Rubisco羧化反应，从而能提高光合速率。
经过3-4周的培养后，用微挑法将藻株挑出后培养在含有BG11培养基的24孔板中，放于光照培养箱中静置培养，培养条 件是温度25℃，光照周期为12h：12h。培养2-3周后再转移到 新培养基中扩大培养。
藻种的鉴定
形态分类法：即在光学显微镜下，对微藻材料采用临时制 片进行观察细胞活体的形态和结构，同时结合藻体固有的 生理生化特征来确定其分类地位。鉴定时主要参考书目为 《中国淡水藻类—系统、分类及生态》等。
Chlorococcum sp. GD 尼罗红染色前后的显微照片。（a）Chlorococcum sp. GD在尼罗红染色前的显微观察照片； （b）Chlorococcum sp. GD在尼罗红染色后的显微照片。（箭头：油脂颗粒）
藻株 共生藻
单位体积藻粉干重 （mg/L） 500mg/L
总脂含量 （%dw）
7,10,13-Hexadecatrienoic acid
5.232
4
32.697 4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid (all-Z)-
5.873
5
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
33.873
Octadecanoic acid
8.745
6
34.522
9-Octadecenoic acid (Z)-
混养培养
当对特定种类的微藻同时提供CO2 和有机碳源时， 微藻可进行兼养生长。
光自养-异养串联培养
异养-光自养串联培养
按进料方式分
批次培养 流加培养 半连续培养 连续培养
批次培养
微藻批次培养模式具有操作简单、成本低的优点， 是实验室内普遍采用的一种培养方式。
近年来，批次培养在“两步法” 藻细胞特定产物的规模培养中得 到了较广泛的应用。第一步，提 供足够的营养盐进批次培养，使 藻细胞积累较高的生物量；第二 步，缺乏或限制营养元素，从而 提高藻体内特定目标产物的含量。
按培养密闭程度分
开放式培养：指藻液直接与外界空气相通的一种培养 方式，如敞开式大池培养，是生产性培养的主要方式。
优点：建池简单，投资少，运行费用低，可利用光温适宜但不宜种植传统 农作物的地区或产量低的荒漠、盐碱沙地等。生产操作简单，容易清洗。 缺点：CO2供应不足，温度不易控制，水分蒸发严重，光能利用率低，占 地广大。易污染，生产不稳定，藻体不易于收获，产量和质量难以保证。
CO2等温室气体的处理：吸附、 碳固存、人工光合系统、生物
固碳。
基建投资大、运行管理 成本高昂、效率较低、 二次污染、潜在技术、 比重较低
新能源开发：太阳能、风能、地 热能、生物质能。
亟需寻求新的高效低成本解决方案
Biofuels production (thousand tonnes)
70000
流加培养
流加培养也称为分批补料培养，是指在培养过程中 向培养液中添加一种或多种营养物质的培养方法。
流加培养分为恒速流加和变速流加两种方式。恒速 流加是以均匀的流加速度逐渐向培养液内加入营养 盐；而变速流加则是根据培养生物的生长特点进行 非线性流加的一种培养方式。
绿
红
硅
藻
藻
藻
物种 淡水微藻 海洋微藻
已发现数量 2.2×104 0.7×104
已发现占估计数比例(%) ＞90 ＜10
为什么是微藻？
光合作用效率是指绿色植物通过光合作用制 造的有机物中所含有的能量与光合作用所吸收的 光能的比值。
光 合 作 用 效 率 高 植物：1%
藻：3.5%
微藻通过光合作用固定CO2的效率比陆生植物更高
优良微藻藻种
微藻采收
(膜过滤) (离心)
CO2
烟气减排
光合反应器 或培养池
规模化培养
酒精 饲料添加 综合利用
提炼后的藻渣
或
生
物 离心分离
柴 油
油和藻渣
湿藻泥
油 提 炼
藻种的筛选 自然界中分离、纯化具有潜在价 值的微藻藻株的一般步骤和流程
分离和纯化的方法主要有传统的技术(加富培养、利 用毛细管挑取单个细胞、固体琼脂平板划线分离、 稀释法)和先进的技术(流式细胞仪分选、微孔板和微 流控技术)。
微藻的筛选与培养
环境危机
水污染
氮、磷 水体富营养化
重金属 土壤污染及人体伤害
POPs 人体伤害
环境危机
温室效应
能源危机
非再生能源储量日渐 减少，面临枯竭。
我国非化石能源比例 偏高，不利于经济高 速优质发展。
环境与能源危机的解决途径
基于物理、化学以及生物方法的 污水处理技术的开发：絮凝、吸 附、高级氧化、活性污泥工艺等。
2种平板式光生物反应器
管道式光生物反应器
目前，已开发设计出不同类型的光合管道，包括水 平式、倾斜式、螺旋形、锥形等，其管道直径小， 一般不超过0.1 m。
2种管道式光生物反应器
搅拌型光生物反应器
机械搅拌式生物反应器广泛运用在微生物培养上， 只要在其内部配套相应的光源，就可成为适合培养 微藻的光生物反应器。
摘取少许苔藓新鲜茎叶，流水冲洗15 min后用蒸馏水洗涤3次， 在超净工作台上用软毛刷反复清理苔藓植物表面，然后用 Tween20进行清洗，再用蒸馏水冲洗5次，将第5次冲洗完的 无菌水收集。在无菌条件下，用研钵将清洗过的苔藓材料研 磨制成匀浆液，接入BG-11液体培养基中，放于光照培养箱 中培养，培养条件是温度25 ℃，光照周期为12h：12h。光照 强度是25 μmol· m-2·s-1。第五次冲洗用的无菌水也接入BG-11 液体培养基，在相同的条件下培养。20天后，每五天对培养 的第五次清洗的无菌水进行镜检。作为检验苔藓植物表面是 否清洗干净的对照。
1、反应物浓度更高
近3000倍
1 L空气中含有约5.9×10-4 g CO2
2、产物浓度更低
1 L水中含有约1.7 g CO2
1/40
1 L空气中含有约0.3 g O2
1 L水中含有约0.008 g O2
3、光照几率更多
折射 衍射
水 散射
由于水对光具有折射、衍射、散射等效应，使得微藻所 有表面都有可能受光照，然而陆生植物只有向光面才有可能 受光照。