胰岛素生产流程图
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Guan HCl WFI-2
S-127
CNBr/HCOOH
W F I -1
S -1 3 0 L iq W a s t e 3
S -1 3 2 S -1 2 1 S -1 1 5 S -1 1 4
P-17 / DE-101 P-18 / CSP-101
S -1 2 9 S -1 1 7
P-14 / DS-101
Air Filtration
A ir
Blending / Storage
S -1 4 3
S-110 P-3 / MX-101
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Fermentation
Storage
S-111
Centrifugation
MrETOH/Urea
S -1 0 9
Mixing
P-4 / G-101
Centrifugal Compression
Centrifugation
IB Solubilization
S -1 5 8 S -1 5 9 S -1 6 0
Diafiltration
P-20 / V-105
Sulfitolysis
WFI-4 WFI-3
S -1 4 9 S -1 4 6 S -1 4 7 S -1 4 8 S -1 5 0 E n zym e s S -1 5 2 S -1 5 3 S -1 5 1
Centrifugation
Blending / Storage 加与菌泥等体积的缓冲液 (96.4%w/w WFI注射用水, 0.7%EDTA, 和2.9% TRIS-base) 稀释,有利于菌体碎片与包 涵体分离
Homogenization Centrifugation
用前面的碟片 式离心机回收 包涵体收率 98%
Centrifugation
再次离心， 去除菌体碎 片和可溶性 蛋白 共用前面回 收工段的碟 片离心机
IB Solubilization
玻璃反应釜内加终浓度 为300g/L(5M)的尿素 （溶解变性蛋白）和 40g/L的 2-巯基乙醇 （减少二硫键的结合）
过滤去除细小颗 粒，保护后续层 析柱。 终体积5200L
Primary Recovery Section
三次高压匀 浆机破菌释 放包涵体 压降800bar
L iq W a s te 2
终物料体积： 1400L
Triton-X-100
S -1 2 5
P-11 / HG-101 P-38 / V-109
P-13 / DS-101 P-10 / V-110
P-9 / DS-101
Liq Waste 9 Liq Waste 7 P-24 / DF-102 Liq Waste 8 P-36 / C-101 MrEtOH P-23 / V-107 P-22 / C-102
pH4 收率90%
HIC Column
Diafiltration
床直径：140cm 床高度：25cm 填料：SP Sepharose FF, GE 洗脱液：29% w/w尿素， 1.5%NaCl, 69.5%WFI
S-Sepharose
再折叠的目的是去除 SO3，然后使二硫键形 成，并再折叠成胰岛 素原的正确天然结构
Refolding
反应工段—酶转化
WFI-4
S -1 5 1
S-154
E n zym e s S -1 5 3 S -1 5 6 L iq W a s t e 1 1
P-27 / DF-102L iq P-26 / V-108
W a ste 1 0
P-25 / C-103
Diafiltration
S-Sepharose
Enzyme Conversion
终纯化工段
Final Purification Section
S -1 7 3 S -1 7 4 S -1 7 5 W F I -6 S -1 6 5 S -1 6 6 S -1 6 7 W F I -5
P-4 / G-101
Centrifugal Compression
初回收工段—物料温度保持10度
--三个平行的碟片 式离心机收获菌体 --菌液从37000L浓 EDTA Solution S -1 3 8 缩到9165L菌泥 --菌体收率98%
L iq w a s t e 1 S -1 4 2 S -1 1 8
通气量： 0.5VVM
S-110 P-3 / MX-101
P-7 / V-102
P-19 / V-106
Fermentation
空罐体积：50立方米 前接2级种子罐 发酵周期：18小时 发酵温度：37度 终菌密度：30克（干重）/升 包涵体含量：干重的20% 终保温：10度
Storage
Mixing
Fermentation Section
S -1 0 7
P-6 / AF-102
S-108
Air Filtration
P-2 / ST-101 S -1 0 6 P-1 / V-101
Mixing
A m m o n ia
Heat Sterilization
S -1 0 1
P-5 / AF-101
Air Filtration
P-15 / V-103
Diafiltration
P-20 / V-105
共用前面 包涵体溶 解过程的 透析器
Sulfitolysis
亚硫酸分解的目的是打 开胰岛素原和二硫键， 给半胱氨酸加上SO3部分
在CNBr沸点 35度旋转真 空蒸发1小时
CNBr Cleavage
70%甲酸溶液 30倍过量加入CNBr (理论摩尔比1:1) 收率95%
S -1 4 2 S -1 1 8
S-104 P-38 / V-109
P-11 / HG-101
P-13 / DS-101 P-10 / V-110
P-5 / AF-101
Blending / Storage
P-7 / V-102 P-19 / V-106 P-9 / DS-101
Homogenization Centrifugation
WFI-2
会产生少 量有毒氰 化物气体， 现场应准 S-127 备次氯酸 盐
S-111
反应时间：12小时 反应温度：20度 利用前面溶解反应釜
CNBr/HCOOH
P-18 / CSP-101
S -1 2 9
S -1 1 7
S-128 P-21 / DF-101 Liq Waste 6
Rotary Evaporator
L iq W a s t e 1 2
P-30 / DF-103
Diafiltration
P-28 / C-104
Gel Filtration
Diafiltration
RP-HPLC
Basket Centrifugation
Crystallization
Media
W a te r
S -1 0 2
发酵工段
S -1 6 5 S -1 6 6 W F I -6 S -1 6 7 W F I -5 S -1 7 5
S-Sepharose
Refolding
S -1 8 6
S -1 3 7 S -1 2 4 S -1 7 2
Product P-35 / FDR-101
S -1 5 7
P-33 / DF-104
Blending / Storage 加2倍体积的清洗剂 (0.66% Triton-X100), 洗涤包涵体
反应工段—溶解包涵体
包涵体内Trp-LE’-Met-proinsulin 含量 ：80% w/w
W F I -1
反应时间：8小时 溶解收率：95%
S -1 3 0 L iq W a s te 3
Reactions Section
S-135
S -1 3 6 S -1 2 3
S-154
S -1 5 6 L iq W a s t e 1 1
S -1 1 9 S -1 4 4 S -1 4 1
Liq Waste 9 Liq Waste 7 P-24 / DF-102 Liq Waste 8 P-36 / C-101 MrEtOH P-23 / V-107 P-22 / C-102 P-26 / V-108
L iq W a s t e 1 6
L iq W a s t e 1 5
Freeze Drying
Liq Waste 17 P-34 / BCF-101
Diafiltration
P-12 / V-111
P-31 / C-105
L iq W a s t e 1 4
P-29 / DF-103 L iq
W a s te 1 3
P-27 / DF-102L iq
W a s te 1 0
P-25 / C-103
Diafiltration
S-Sepharose
S -1 6 1
HIC Column
Enzyme Conversion
Diafiltration
S -1 7 3 S -1 7 4 S -1 2 6 S -1 6 2
Final Purification Section
反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个
氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的Proinsulin
pH 9-11，50%w/w(6M)盐酸 胍，0.35%碳酸氢铵，3%硫 酸钠，1.5%过硫酸钠，反应 时间12小时，收率95%
Guan HCl
WFI透析至盐 酸胍浓度为 20%w/w
人重组胰岛素（E.coli）生产流程
• • • • 发酵工段 初回收工段 反应工段 终纯化工段
Media
W a te r
S -1 0 2
Primary Recovery Section Fermentation Section
S -1 0 7
P-6 / AF-102
S-108 EDTA Solution
E.Coli胰岛素原法 转化流程
市场分析和设计基础（2005）
• 糖尿病人数：美国1800万，全世界1.5-2.0亿，年增 长率3-4% • 胰岛素年销售额35-40亿美元, 由Novo Nordisc、Eli Lilly和Sanofi Aventis三家垄断 • 每个患者每年购买胰岛素的花费：$250-750 • 每个病人每年平均用量：0.5克纯胰岛素 • 对1.5-2.0亿患者，年需求75-100吨纯胰岛素 • 目前年产量20-30吨纯胰岛素 • • • • 设计年产量：1800kg纯胰岛素，满足350万人 年工作330天，每48小时生产一批次，每年160批次 每批次发酵液体积：37.5立方米， 发酵罐空罐体积：50立方米
S -1 3 8 L iq W a s t e 2
Air Filtration
P-2 / ST-101 P-1 / V-101
S -1 0 6 L iq w a s t e 1
Triton-X-100
S -1 2 5
Mixing
A m m o n ia
Heat Sterilization
S -1 0 1
胰岛素(E.Coli)生产流程
人胰岛素—碳水化合物代谢和体细胞供能
一级结构：51个氨基酸 双链（A：21，B：30） 分子量：5734 g/mol 等电点：5.4
胰岛素产生 受损导致糖 尿病
人胰岛素的制备方法
• • • • 人胰腺提取---原料来源有限 通过单个氨基酸化学合成---生产成本太高 猪胰岛素转化或“半合成”--成本高，来源少 基因工程菌发酵 --双链—Genentech,开发，Eli Lilly 放大 --胰岛素原（82个氨基酸，胰岛素的前体） --分泌法（Yeast），Novo Nordisk产业化 --细胞内法（E.coli），表达121+82个氨基酸 的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵体，Eli Lilly 产业化
S -1 3 2
S -1 1 5
S -1 1 4
P-17 / DE-101
P-14 / DS-101
Dead-End Filtration Liq Waste 4 P-16 / DF-101
Liq Waste 5
Diafiltration
WFI透析6小时， 收率98%， 去除尿素和 2-巯基乙醇
P-8 / V-103
Dead-End Filtration Liq Waste 4 P-16 / DF-101
Liq Waste 5 P-15 / V-103
S-128 P-21 / DF-101 Liq Waste 6
Rotary Evaporator CNBr Cleavage
Diafiltration
P-8 / V-103
反应工段—再折叠
三个平行阳离子交 换层析床纯化
proinsulin
Reactions Section
S-135
S -1 3 6 S -1 2 3 S -1 5 2
加入巯基乙醇
WFI-3
S -1 4 9
S -1 4 6 S -1 4 7 S -1 4 8
S -1 1 9 S -1 4 4 S -1 4 1
S-127
CNBr/HCOOH
W F I -1
S -1 3 0 L iq W a s t e 3
S -1 3 2 S -1 2 1 S -1 1 5 S -1 1 4
P-17 / DE-101 P-18 / CSP-101
S -1 2 9 S -1 1 7
P-14 / DS-101
Air Filtration
A ir
Blending / Storage
S -1 4 3
S-110 P-3 / MX-101
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Fermentation
Storage
S-111
Centrifugation
MrETOH/Urea
S -1 0 9
Mixing
P-4 / G-101
Centrifugal Compression
Centrifugation
IB Solubilization
S -1 5 8 S -1 5 9 S -1 6 0
Diafiltration
P-20 / V-105
Sulfitolysis
WFI-4 WFI-3
S -1 4 9 S -1 4 6 S -1 4 7 S -1 4 8 S -1 5 0 E n zym e s S -1 5 2 S -1 5 3 S -1 5 1
Centrifugation
Blending / Storage 加与菌泥等体积的缓冲液 (96.4%w/w WFI注射用水, 0.7%EDTA, 和2.9% TRIS-base) 稀释,有利于菌体碎片与包 涵体分离
Homogenization Centrifugation
用前面的碟片 式离心机回收 包涵体收率 98%
Centrifugation
再次离心， 去除菌体碎 片和可溶性 蛋白 共用前面回 收工段的碟 片离心机
IB Solubilization
玻璃反应釜内加终浓度 为300g/L(5M)的尿素 （溶解变性蛋白）和 40g/L的 2-巯基乙醇 （减少二硫键的结合）
过滤去除细小颗 粒，保护后续层 析柱。 终体积5200L
Primary Recovery Section
三次高压匀 浆机破菌释 放包涵体 压降800bar
L iq W a s te 2
终物料体积： 1400L
Triton-X-100
S -1 2 5
P-11 / HG-101 P-38 / V-109
P-13 / DS-101 P-10 / V-110
P-9 / DS-101
Liq Waste 9 Liq Waste 7 P-24 / DF-102 Liq Waste 8 P-36 / C-101 MrEtOH P-23 / V-107 P-22 / C-102
pH4 收率90%
HIC Column
Diafiltration
床直径：140cm 床高度：25cm 填料：SP Sepharose FF, GE 洗脱液：29% w/w尿素， 1.5%NaCl, 69.5%WFI
S-Sepharose
再折叠的目的是去除 SO3，然后使二硫键形 成，并再折叠成胰岛 素原的正确天然结构
Refolding
反应工段—酶转化
WFI-4
S -1 5 1
S-154
E n zym e s S -1 5 3 S -1 5 6 L iq W a s t e 1 1
P-27 / DF-102L iq P-26 / V-108
W a ste 1 0
P-25 / C-103
Diafiltration
S-Sepharose
Enzyme Conversion
终纯化工段
Final Purification Section
S -1 7 3 S -1 7 4 S -1 7 5 W F I -6 S -1 6 5 S -1 6 6 S -1 6 7 W F I -5
P-4 / G-101
Centrifugal Compression
初回收工段—物料温度保持10度
--三个平行的碟片 式离心机收获菌体 --菌液从37000L浓 EDTA Solution S -1 3 8 缩到9165L菌泥 --菌体收率98%
L iq w a s t e 1 S -1 4 2 S -1 1 8
通气量： 0.5VVM
S-110 P-3 / MX-101
P-7 / V-102
P-19 / V-106
Fermentation
空罐体积：50立方米 前接2级种子罐 发酵周期：18小时 发酵温度：37度 终菌密度：30克（干重）/升 包涵体含量：干重的20% 终保温：10度
Storage
Mixing
Fermentation Section
S -1 0 7
P-6 / AF-102
S-108
Air Filtration
P-2 / ST-101 S -1 0 6 P-1 / V-101
Mixing
A m m o n ia
Heat Sterilization
S -1 0 1
P-5 / AF-101
Air Filtration
P-15 / V-103
Diafiltration
P-20 / V-105
共用前面 包涵体溶 解过程的 透析器
Sulfitolysis
亚硫酸分解的目的是打 开胰岛素原和二硫键， 给半胱氨酸加上SO3部分
在CNBr沸点 35度旋转真 空蒸发1小时
CNBr Cleavage
70%甲酸溶液 30倍过量加入CNBr (理论摩尔比1:1) 收率95%
S -1 4 2 S -1 1 8
S-104 P-38 / V-109
P-11 / HG-101
P-13 / DS-101 P-10 / V-110
P-5 / AF-101
Blending / Storage
P-7 / V-102 P-19 / V-106 P-9 / DS-101
Homogenization Centrifugation
WFI-2
会产生少 量有毒氰 化物气体， 现场应准 S-127 备次氯酸 盐
S-111
反应时间：12小时 反应温度：20度 利用前面溶解反应釜
CNBr/HCOOH
P-18 / CSP-101
S -1 2 9
S -1 1 7
S-128 P-21 / DF-101 Liq Waste 6
Rotary Evaporator
L iq W a s t e 1 2
P-30 / DF-103
Diafiltration
P-28 / C-104
Gel Filtration
Diafiltration
RP-HPLC
Basket Centrifugation
Crystallization
Media
W a te r
S -1 0 2
发酵工段
S -1 6 5 S -1 6 6 W F I -6 S -1 6 7 W F I -5 S -1 7 5
S-Sepharose
Refolding
S -1 8 6
S -1 3 7 S -1 2 4 S -1 7 2
Product P-35 / FDR-101
S -1 5 7
P-33 / DF-104
Blending / Storage 加2倍体积的清洗剂 (0.66% Triton-X100), 洗涤包涵体
反应工段—溶解包涵体
包涵体内Trp-LE’-Met-proinsulin 含量 ：80% w/w
W F I -1
反应时间：8小时 溶解收率：95%
S -1 3 0 L iq W a s te 3
Reactions Section
S-135
S -1 3 6 S -1 2 3
S-154
S -1 5 6 L iq W a s t e 1 1
S -1 1 9 S -1 4 4 S -1 4 1
Liq Waste 9 Liq Waste 7 P-24 / DF-102 Liq Waste 8 P-36 / C-101 MrEtOH P-23 / V-107 P-22 / C-102 P-26 / V-108
L iq W a s t e 1 6
L iq W a s t e 1 5
Freeze Drying
Liq Waste 17 P-34 / BCF-101
Diafiltration
P-12 / V-111
P-31 / C-105
L iq W a s t e 1 4
P-29 / DF-103 L iq
W a s te 1 3
P-27 / DF-102L iq
W a s te 1 0
P-25 / C-103
Diafiltration
S-Sepharose
S -1 6 1
HIC Column
Enzyme Conversion
Diafiltration
S -1 7 3 S -1 7 4 S -1 2 6 S -1 6 2
Final Purification Section
反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个
氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的Proinsulin
pH 9-11，50%w/w(6M)盐酸 胍，0.35%碳酸氢铵，3%硫 酸钠，1.5%过硫酸钠，反应 时间12小时，收率95%
Guan HCl
WFI透析至盐 酸胍浓度为 20%w/w
人重组胰岛素（E.coli）生产流程
• • • • 发酵工段 初回收工段 反应工段 终纯化工段
Media
W a te r
S -1 0 2
Primary Recovery Section Fermentation Section
S -1 0 7
P-6 / AF-102
S-108 EDTA Solution
E.Coli胰岛素原法 转化流程
市场分析和设计基础（2005）
• 糖尿病人数：美国1800万，全世界1.5-2.0亿，年增 长率3-4% • 胰岛素年销售额35-40亿美元, 由Novo Nordisc、Eli Lilly和Sanofi Aventis三家垄断 • 每个患者每年购买胰岛素的花费：$250-750 • 每个病人每年平均用量：0.5克纯胰岛素 • 对1.5-2.0亿患者，年需求75-100吨纯胰岛素 • 目前年产量20-30吨纯胰岛素 • • • • 设计年产量：1800kg纯胰岛素，满足350万人 年工作330天，每48小时生产一批次，每年160批次 每批次发酵液体积：37.5立方米， 发酵罐空罐体积：50立方米
S -1 3 8 L iq W a s t e 2
Air Filtration
P-2 / ST-101 P-1 / V-101
S -1 0 6 L iq w a s t e 1
Triton-X-100
S -1 2 5
Mixing
A m m o n ia
Heat Sterilization
S -1 0 1
胰岛素(E.Coli)生产流程
人胰岛素—碳水化合物代谢和体细胞供能
一级结构：51个氨基酸 双链（A：21，B：30） 分子量：5734 g/mol 等电点：5.4
胰岛素产生 受损导致糖 尿病
人胰岛素的制备方法
• • • • 人胰腺提取---原料来源有限 通过单个氨基酸化学合成---生产成本太高 猪胰岛素转化或“半合成”--成本高，来源少 基因工程菌发酵 --双链—Genentech,开发，Eli Lilly 放大 --胰岛素原（82个氨基酸，胰岛素的前体） --分泌法（Yeast），Novo Nordisk产业化 --细胞内法（E.coli），表达121+82个氨基酸 的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵体，Eli Lilly 产业化
S -1 3 2
S -1 1 5
S -1 1 4
P-17 / DE-101
P-14 / DS-101
Dead-End Filtration Liq Waste 4 P-16 / DF-101
Liq Waste 5
Diafiltration
WFI透析6小时， 收率98%， 去除尿素和 2-巯基乙醇
P-8 / V-103
Dead-End Filtration Liq Waste 4 P-16 / DF-101
Liq Waste 5 P-15 / V-103
S-128 P-21 / DF-101 Liq Waste 6
Rotary Evaporator CNBr Cleavage
Diafiltration
P-8 / V-103
反应工段—再折叠
三个平行阳离子交 换层析床纯化
proinsulin
Reactions Section
S-135
S -1 3 6 S -1 2 3 S -1 5 2
加入巯基乙醇
WFI-3
S -1 4 9
S -1 4 6 S -1 4 7 S -1 4 8
S -1 1 9 S -1 4 4 S -1 4 1