微生物发酵改善菜籽粕品质的研究

降解率为 43. 15% 略高。而国内研究中硫甙的降解 率则相对较高，李延海等［6］使用白地霉菌配合硫酸
铵发 酵 处 理 菜 籽 粕，硫 甙 降 解 率 达 到 85% ; 孙 林 等［7］以植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、
酪酸梭状芽孢杆菌发酵结合湿热处理菜籽粕，硫甙
的降解率达到 85. 19% ，但菜籽粕在剧烈加热条件
体外消化率 = ( m1 － m0 ) / m0 × 100%
( 1)
式中: m0 ———样品中粗蛋白质质量，mg;
m1 ———酶解后残渣中的粗蛋白质质量，mg。
1. 8 乳酸含量的测定
1. 8. 1 样品的预处理
称取 5 g 样 品，加 入 超 纯 水 50 mL，搅 拌 提 取
5 min，取 20 mL 匀浆液在 4 000 × g 离心 15 min，取
2. 1 微生物发酵对菜籽粕中硫甙含量的影响
经 测 定，发 酵 前 菜 籽 粕 中 硫 甙 含 量 为 42. 98
μmol / g，发酵后菜籽粕中硫甙含量为 20. 01 μmol / g，
பைடு நூலகம்
经微生物 发 酵，硫 甙 的 降 解 率 达 到 了 53. 4% 。比 Vig 等［5］采用少孢根霉菌固态发酵菜籽粕，硫甙的
( 1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122， Jiangsu，China; 2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China)
SDS － PAGE 电泳的分离胶质量分数 12. 5% ， 浓缩胶质量分数 5% ，电泳时，取 20 μL 的样品加入 5 μL 的上样缓冲液，混匀后在沸水中水浴 5 min，再 于 10 000 × g 离心 30 s。上样量 15 μL，样品在浓缩 胶时电压 60 V，进入分离胶后上升至 80 V，当溴酚 蓝距离下缘 0. 5 ～ 1. 0 cm 时结束电泳。胶片用考马 斯亮蓝 R250 染色。 1. 6 菜籽肽含量的测定
210 nm; 色 谱 柱: ECOSIL HPLC COLUMN C18 ，4. 6 mm × 250 mm; 柱温: 30 ℃; 流动相: V( 甲醇) ∶ V( 水) ∶
V( H3 PO4 ) = 5∶ 95∶ 0. 05; 流速: 0. 8 mL / min; 进样量: 5 μL。
2 结果与讨论
抽滤，分别用 15 mL 乙醇和 15 mL 丙酮洗涤残渣，抽
滤结束后，将滤纸及残渣放入 105 ℃ 烘箱烘 3 h，称
量，然后利用凯氏定氮仪测定蛋白质含量。由公式
( 1) 计算蛋白质的体外消化率。将菜籽粕经过胃蛋
白酶消化 1 h，胰蛋白酶消化 3 h 的体外消化率定义
为菜籽粕蛋白质的快速体外消化率。
下会破坏 蛋 白 质 的 品 质，不 利 于 非 反 刍 动 物 的 吸 收［14］。在低硫 甙 菜 籽 粕 的 使 用 上，于 炎 湖 等［15］ 的
研究表明，在 生 长 猪 肥 育 前 期 日 粮 中，双 低 菜 籽 粕
( 硫甙含量 37 μmol / g) 的用量比例为 16% ，后期日
粮中添加 18% 菜籽粕，猪的正常生长不受影响。卿 中全等［16］的研究表明，在肥育猪种猪和种猪的日粮
采用卡氏酵母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进 行菜籽粕的混合固态发酵。菜籽粕( 100 g) 和自来 水按 1∶ 0. 7 比例混合，接种 10 mL 的枯草芽孢杆菌， 于 37 ℃ 发酵 12 h 后，再接入 10 mL 卡氏酵母和 10 mL 植物乳杆菌，37 ℃ 发酵 36 h 后，于 60 ℃ 烘干，粉 碎后得到发酵菜籽粕。 1. 3 硫甙含量的测定
中国油脂
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( 1∶ 10 000) 、胰蛋白酶 ( 1 ∶ 250 ) 和丙烯基硫甙购自 Sigma 公司; Sep － PakC18 Cartridge 购自美国 Waters 公 司; RCDC 蛋白定量试剂盒购自 BIO － RAD 公司; 其 他试剂均购自中国医药集团上海试剂公司。卡氏酵 母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌来源于实验室筛选。 1. 2 发酵工艺
量，提高菜籽粕的利用率。 2. 2 微生物发酵对菜籽粕中粗蛋白质含量和氨基 酸组成变化的影响
经过微生物发酵后，菜籽粕中粗蛋白质含量由 原来的 39. 99% 提高到 45. 84% ，这主要是因为微生 物在代谢过程中产气，损失掉一部分样品，使蛋白质 得到了一定程度的浓缩。通过对比发酵前后菜籽粕 中各种氨基酸组成可知，发酵后菜籽粕中各种氨基 酸的成分比发酵前均有所提高，且氨基酸总量由发 酵前的 31. 02% 提高到 34. 87% ( 见表 1) 。
本文利用酵母、枯草芽孢杆菌和乳酸菌对菜籽 粕进行混合发酵，使菜籽粕中主要的有害物质硫甙 得到高效降解，蛋白质发生一定程度的降解，积累有 益的代谢产物小肽和乳酸，达到综合改善菜籽粕品 质的目的。 1 材料与方法 1. 1 试验材料
菜 籽 粕 购 自 无 锡 市 农 贸 市 场; 胃 蛋 白 酶
2011 年 第 36 卷 第 7 期
菜籽粕粗蛋白质含量为 35% ～ 45% ，氨基酸组 成合理，是 一 种 较 为 优 良 而 廉 价 的 蛋 白 质 饲 料 资 源［1］。然而，因其含有硫甙、植酸、单宁等有害物质 和抗营养因子，直接作为饲料利用会引起营养物质 利用率下降及畜禽中毒等副作用，从而限制了菜籽 粕在饲料行业的利用。
目前，饲料行业基本上认可双低菜籽粕，较为成 功的 双 低 品 种 有 Canola、Tower、Regent、Candle 和 Altex等［2］。然而，由于这些欧美等地的品种具有稳 定的地理生态类型，与我国长江下游的生态差异较 大，不适合 直 接 引 种［3］，而 我 国 的 油 菜 新 品 种 的 培
中，Canola 菜籽粕( 硫甙含量 ＜ 30 μmol / g) 可 100%
代替大豆粕。因此，通过微生物发酵将菜籽粕中硫
甙含量降解至国际公认的双低菜籽粕的标准值( 30
μmol / g) 以下，就可以提高其在动物饲料中的添加
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CHINA OILS AND FATS
2011 Vol. 36 No. 7
上清液 10 mL 于 13 000 × g 离心 10 min。上清液用
0. 22 μm 的膜过滤，再用 Sep － PakC18 Cartridge 过滤 处理后备用，采用 HPLC 测定乳酸含量［13］。
1. 8. 2 色谱条件
HPLC: Agilent 1100; 四 元 流 动 泵; 检 测 器: UV
乳酸含量以及蛋白质体外消化率的变化。结果表明，菜籽粕中的硫甙降解率为 53. 4% ，粗蛋白质
含量从 39. 99% 提高到 45. 84% ，菜籽肽含量由 2. 48% 提高到 10. 58% ，氨基酸的组成和含量也有
一定的变化和提高，蛋白质的快速体外消化率提高了 1. 94% ，有益代谢产物乳酸的含量由 1. 03%
提高到 2. 53% 。
关键词: 菜籽粕; 微生物发酵; 硫甙; 菜籽肽; 体外消化
中图分类号: TS229; S816
文献标志码: A
文章编号: 1003 － 7969( 2011) 07 － 0024 － 05
Improving the quality of rapeseed meal by microbial fermentation WANG Gang1，2 ，CAI Guolin2 ，LU Jian1，2
收稿日期: 2010 － 11 － 11 作者简介: 王 刚( 1987) ，男，硕士研究生，主要从事发酵工 程方面的研究与开发工作( E-mail) hiwanggang@ 163． com。 通信作者: 陆 健，教授，博士生导师。
育工作起步较晚，且育成的双低品种表现出生长势 弱，抗病 性 差 等 特 点［4］。 另 外，在 生 产 上 我 国 普 通 油菜和双低油菜混种、混收、混加现象严重，无法保 证双低油菜的品质。同时，低硫甙的菜籽粕和鱼粉、 豆粕等高品质的蛋白饲料相比，其营养价值仍有较 大的不足［2］。因此，要想充分利用菜籽粕中蛋白质 资源，必须开发菜籽粕中硫甙的脱毒方法，微生物发 酵就是一种行之有效的解决方法［5 － 7］。
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2011 Vol. 36 No. 7
油料蛋白
微生物发酵改善菜籽粕品质的研究
王 刚1，2 ，蔡国林2 ，陆 健1，2
( 1. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122; 2. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122)
摘要: 采用实验室筛选的菌种混合固态发酵菜籽粕，比较菜籽粕发酵前后硫甙、粗蛋白质、菜籽肽、
Abstract: Rapeseed meal was fermented by laboratory screening stains under solid state． The changes of glucosinolates，crude protein，rapeseed peptide，lactic acid of rapeseed meal and the in vitro digestibility of protein were studied． The results showed that the degradation rate of glucosinolates was 53. 4% ，the contents of crude protein and rapeseed peptide increased from 39. 99% to 45. 84% ，and from 2. 48% to 10. 58% ，respectively． The composition of amino acid had a certain change and its content increased． The rapid in vitro digestibility of protein increased by 1. 94% ，and the content of benefical metabolite lactic acid increased from 1. 03% to 2. 53% ． Key words: rapeseed meal; microbial fermentation; glucosinolates; rapeseed peptide; in vitro digestibility
参考大豆肽粉的测定方法测定菜籽肽的含量， 酸溶蛋白的含量减去游离氨基酸的含量即为菜籽肽 的含量［11］。 1. 7 蛋白质体外消化率的测定
根据王潍 波 等［12］ 的 测 定 方 法 略 作 修 改。 称 取 样品 4 份，每份 0. 500 0 g，各加入 50 mg / mL 的胃蛋 白酶 1 mL，于 37 ℃ 、85 r / min 下分别消化 1、2、3、6 h 后，调节 pH 至 7. 5，然后各加入 340 mg / mL 胰蛋白 酶溶液 1 mL，于 39 ℃ 继续消化 3、6、9、18 h，消化结 束后，加入 5 mL 20% 的磺基水杨酸溶液，室温放置 30 min，沉淀蛋白质。随后用烘至绝干的定性滤纸
以丙烯基硫甙作为硫甙的标准品，绘制硫甙的 标准曲线，利用分光光度法测定硫甙含量［8］。 1. 4 蛋白质含量及氨基酸组成的测定
粗蛋白质含量和氨基酸组成分别采用凯氏定氮 仪和氨基酸自动分析仪测定［9］。 1. 5 菜籽粕蛋白的 SDS － PAGE 分析 1. 5. 1 样品制备
称取粉碎菜籽粕( 60 目) 1. 000 0 g，用 0. 03 mol / L Tris － HCl 缓冲液( pH 8. 0) 10. 00 mL 浸提 2 h，然后于 3 000 × g、4 ℃ 离心 10 min，取上清液，再于 10 000 × g、4 ℃ 离心 10 min，取上清液测定蛋白质质量浓度， 稀释至 1 mg / mL，4 ℃ 保存备用。 1. 5. 2 SDS － PAGE 测定［10］