第二章 蛋白样品的预处理

水平转子
垂直转子 角式转子的特殊形式，主要用于等密度梯度离心 ，这种转子使蛋白移动距离短，比水平和角转子节 约时间，但速度剧变容易产生对流扰乱
垂直转子
转子的材质： 铝质 不锈钢 钛合金 较轻,耐受强度较弱,适合在较低 的转速下使用 耐受强度最好,但材质本身太重 耐受强度不错,重量比不锈钢轻
2.1.2.3 过滤
一般含： 主机、 传感头、 隔音箱
美国Sonics品牌超声波破碎仪，世界最著名品牌 1. 简洁、便携式，样品处理量0.15-150ml/1-1000ml 2. 微电脑控制，可根据样品自动调整到最佳的频率及超 声波强度 3. LCD参数显示及时间显示
国产的超声波破碎仪
2.1.1.2 珠磨法 原理
2.1.2.2 离心技术（centrifugal technique） 离心技术概论 一般制备离心
超离心技术
概述
• 离心是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一个外向 的离心力的行为发展起来的一种分离、分析技术 • 离心技术是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离 的最常用的方法之一
应用
• 工业生产中 化工、制药、食品等领域，转速<5000rpm • 生物、医学、化学等科研领域 转速要求可达103~105rpm 一般目的为分离、分析、纯化样品
离心设备组成 离心机 转子 离心管 附件
转子种类
有角转子、水平转子、垂直转子等几种类型
角转子 指离心时离心管腔与转轴成一定倾角的转子。 蛋白在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心 管，然后再沿管壁滑向管底，因此形成的沉淀面有 一定角度
角转子
水平转子
离心时，转子活动腔内的离心管会随着转子 的 转 动 ， 从 垂 直 悬 吊 转 为 水 平 位 置 （ 约 200800rpm），蛋白在水平转子中的沉降是沿离心管 方向的，因此形成的沉淀面是水平的
高压匀浆机
2.1.1.4 冻融法 原理 • 将待破碎细胞冷却至 -15~-20℃ ，然后置于室温 （或 40℃）迅速融化；如此反复冻融多次，由于 细胞中形成冰晶，以及剩余胞液中盐浓度增高而 使细胞发生溶胀、破裂 • 优点：简单方便，适合于细胞壁较脆弱易破坏的 微生物菌体 • 缺点：破碎率较低，如果目标蛋白对温度变化敏 感不宜采用此法
2.2.1 超滤法
• 是指选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压 力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜， 而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从 而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法 • 截留分子量 (molecular weight cut-off, MWCO)：不 能通过超滤膜的最小分子量 如： MWCO 为 10kDa 超滤膜，截留大于 10kDa 的 所有分子，小于10kDa的分子能通过
• 进行蛋白质盐析沉淀时，最常选取的盐是硫酸铵。 与其它盐相比，具有如下优点：①溶解度大，对 温度不敏感（ 25℃ 时溶解度为 769g/L ， 0℃ 时为 679 ）；②分级沉淀效果好；③ 蛋白在高浓度硫 酸铵存在的环境下，生物学活性保持不变；④价 格低廉，废液可作为农田肥料 • 盐析法一般采用分级沉淀法操作，举例：先选择 25%饱和度硫酸铵，使部分杂蛋白由于盐析作用 沉淀下来，而目标蛋白处于溶解状态而保留在上 清中；弃去沉淀，保留上清，在上清中加入 60% 饱和度硫酸铵，使目标蛋白发生盐析作用而沉淀 下来，弃去上清，沉淀蛋白即可作为后续纯化用
2.1.2 蛋白质样品的粗分离方法
2.1.2.1 聚沉和絮凝
• 聚沉（coagulation）：是指在聚沉剂的作用下， 溶液中的蛋白质相互聚集为较大聚沉物（＞1mm） 的过程 • 原理：金属离子与蛋白发生螯合作用，使其变性， 蛋白疏水基团外露，相互作用而聚集成大分子沉 淀 • 常见的聚沉剂：无机盐类（如氯化锌、氯化铁、 氯化铝、硫酸锌、硫酸铝），聚合无机盐（聚合 铝、聚合铁等）
• 利用固体间研磨剪切力和撞击使细胞破碎，是最 有效的一种细胞物理破碎法 • 一般利用珠磨机进行操作 • 珠磨机的搅拌速度应限制在合适的范围以减少产 生的热量，避免造成蛋白质的失活 • 珠磨法破碎细胞分为间歇或连续操作。珠磨的细 胞破碎效率随细胞种类而异，适用于绝大多真菌 菌丝和藻类等微生物细胞的破碎
• 聚沉条件：-20℃以下，pH3~6，较高离子强度， Baidu Nhomakorabea多价金属离子（Fe3+、Al3+）
• 絮凝（ flocculation）：是指在絮凝剂的作用下， 通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚结为大絮体 沉降的过程 • 大致原理：絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范 德华力，同时吸引大量蛋白，发挥“中间桥梁” 作用，最终聚结成网状絮体结构而沉淀下来 • 常见的絮凝剂：淀粉、树脂、单宁、离子交换树 脂及纤维素衍生物（往往含大量带电基团） • 絮凝作用一般在聚沉作用之后使用；絮凝剂的选 择应根据成本、毒性等具体情况考虑；应通过试 验确定最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件
第二章 蛋白质样品的预处理
Pretreatment of Protein Sample
2.1 蛋白质样品的总提取和粗分离方法
2.2 蛋白质样品的浓缩方法 2.3 蛋白质样品的透析
2.1 蛋白质样品的总提取和粗分离方法
2.1.1 细胞的破碎方法—蛋白质样品的总提取
对于分泌到细胞外的目标蛋白，不需要破碎细胞， 直接提取细胞的培养液进行后续分离纯化即可。 如细菌和霉菌分泌的淀粉酶、蛋白酶等 而对于只分布在细胞内的目标蛋白，首先需破碎 细胞，使目标蛋白释放出来，才能进行后续的分 离纯化。如线粒体中三羧酸循环酶系和氧化磷酸 化酶系，核糖体中的蛋白质合成酶系等 常用的细胞破碎方法有超声波法、珠磨法、高压 匀浆法、冻融法、渗透压冲击法、酶解法
用高浓缩铀生产的核武器
铀浓缩
• 铀是存在于自然界中的一种稀有化学元素，具有放 射性。根据国际原子能机构的定义，丰度为 3% 的 铀 235 为核电站发电用低浓缩铀，铀 235 丰度大于 80%的铀为高浓缩铀，其中丰度大于90%的称为武 器级高浓缩铀，主要用于制造核武器。 • 获得铀是非常复杂的系列工艺，要经过探矿、开矿、 选矿、浸矿、炼矿、精炼等流程，浓缩分离是其中 最后的流程，需要很高的科技水平。获得 1 公斤武 器级铀235需要200吨铀矿石。由于涉及核武器问题， 铀浓缩技术是国际社会严禁扩散的敏感技术。 • 目前除了几个核大国之外，日本、德国、印度、巴 基斯坦、阿根廷等国家都掌握了铀浓缩技术。提炼 浓缩铀通常采用气体离心法，气体离心分离机是其 中的关键设备，因此美国等国家通常把拥有该设备 作为判断一个国家是否进行核武器研究的标准。
超滤离心管（美国Millipore公司）
样品最大处理体积分别为15、4、0.5mL
优点&局限性 • 优点：超滤浓缩技术的优点是操作简便，不需添 加任何化学试剂，实验条件温和，而且不引起温 度、pH的变化，因而可以防止蛋白质分子的变性、 失活。在蛋白质分子的制备技术中，超滤除用于 浓缩外，还可用于蛋白样品的脱盐和脱水 • 局限性：不能直接得到蛋白干粉制剂。对于蛋白 质溶液，一般最终只能浓缩到10~50％的浓度
举例：
将 0.5ml 细 胞 悬 浮 液 加 入 4ml 含 20% 蔗 糖 ， 30mmol/L Tris-HCl（pH8.0，1mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100 ） 高渗溶液中，室温下静置 5min 后， 10000rpm 离心 3min ，收集细胞，弃上清。再加 入 2ml 去离子水（低渗溶液），冰浴中温和搅拌 10min ， 便 可 使 细 胞 破 碎 ， 4℃ 5000rpm 离 心 3min，胞内蛋白即分布于上清中
• 超滤膜的膜材料主要有纤维素及其衍生物、聚碳 酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、 聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、 改性丙烯酸聚合物等 • 目前，以超滤膜为核心开发的超滤浓缩装置可从 Millipore、Whatman、Amicon等公司购买获得， MWCO可为1~1000kDa，样品的处理体积可从几 毫升到几百毫升
2.1.1.5 渗透压冲击法 原理 • 渗透压：将溶液和水置于U型管中，在U型管中间 安置一个半透膜，以隔开水和溶液，可以见到水 通过半透膜往溶液一端跑，假设在溶液端施加压 强，而此压强可刚好阻止水的渗透，则称此压强 为渗透压 • 高渗溶液：指渗透压高的溶液，如蔗糖溶液。一 般溶质浓度越大，渗透压越高，水势能越低；水 由高势能向低势能方向扩散。可做脱水剂 • 操作：将待破碎的细胞先置于高渗溶液中，再转 入低渗溶液或水中，利用渗透压的变化使得细胞 破碎
珠磨机（细胞破碎用）
2.1.1.3 高压匀浆法 原理 • 细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙 高速（可达到450m/s）喷出后撞击到碰撞环上； 细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环 境，在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。操作 压力通常为50~70Mpa • 影响因素：压力、循环操作次数和温度 • 高压匀浆法适用于酵母和细菌细胞的破碎 • 一般使用高压匀浆机进行操作
2.1.1.6 生物酶解法 原理 • 生物酶解法是根据植物细胞壁的构成，利用酶反 应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将 细胞壁的组成成分（纤维素、半纤维素和果胶质） 水解或降解，破坏细胞壁结构，从而达到破碎细 胞目的的方法。如溶菌酶（破坏革兰氏阳性菌细 胞壁）、蜗牛酶（破坏酵母细胞壁）等 • 优点：专一性强，操作条件温和，收率高 • 缺点：成本较高（溶菌酶 ~2600 元 /kg ；蜗牛酶 ~20000元/kg）
离心机
制备型
分析型
分析型超速离心机
(分析型超速离心主要用于检测大 分子物质的沉降特征和结构等)
普通离心机
冷冻离心机
台式（或 台式高、超 大容量冷 高速冷冻 超速冷冻 冻离心机 离心机 离心机 地面式） 速离心机 小于0.6万rpm 0.6-2.5万 2.5-8万或更高 普通离心 0.6-10万rpm 机
2.2.2.1 盐析法 原理 • 蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增 高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值 时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐 析） • 盐析发生的原因：盐浓度增高到一定数值时，水 活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和， 水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互 聚集并从溶液中析出 • 盐析结束后，常需要用透析法或凝胶过滤层析法 对蛋白样品进行脱盐处理
2.2.2 沉淀法
• 指在样品中加入适量的中性盐或有机溶剂等，使 目标蛋白变成沉淀析出，再用合适的缓冲液溶解 沉淀的方法。沉淀法既可达到浓缩蛋白样品目的， 还可部分除去杂质 在生化制备中常用的沉淀方法有： 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 聚乙二醇沉淀法 选择性沉淀法 结晶沉淀法
• ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
原理 • 利用多孔介质（滤纸、滤膜等）阻截大的颗粒物 质，而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。 主要用于悬浮液的分离，最简单、最常用
常规滤纸 (0.22μm)
针筒式滤膜过滤器
2.2 蛋白样品的浓缩
• 目的：为提高样品中蛋白的浓度，尽量缩小样品 的体积，以利于后续的层析分离。 离心或过滤后澄清的样品常常需要进行浓缩。 • 常用的浓缩方法主要有超滤法、沉淀法、冷冻干 燥法、吸附法、双水相分离法
2.1.1.1 超声波法 原理： • 超声波是指振动频率 >20000Hz 以上的声波，其 每秒的振动次数（即振动频率）超出了人耳听觉 的上限（ 20000Hz ），人们将这种听不见的声波 叫超声波 • 常常利用超声波细胞破碎仪对细胞进行超声破碎， 其原理是将电能通过换能器转换为超声波形式的 声能，利用超声波产生的能量使细胞悬浮液中产 生一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂， 产生象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等 物质的作用 • 超声波细胞破碎法能用于各种动植物细胞、病毒 细胞、细菌及组织的破碎
≤1.3万rpm
一般制备型离心
一般制备型离心是指在分离、浓缩、提纯样品中， 不必制备密度梯度的一次完成的离心操作，实验室常 用的低、高速离心机即可完成
台式高速离心机
台式高速离心机
台式高速冷冻离心机
立式高速冷冻离心机
立式超速冷冻离心机
立式超速冷 冻离心机
应用范围： ■病毒及亚细胞组份分离 ■蛋白梯度分离 ■脂蛋白分离 ■RNA梯度沉淀 ■质粒DNA提纯