微生物实验论文

兰州大学生命科学学院

微生物学实验

微生物的染色与形态结构

观察

摘要：微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察

时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以观察它们的形态，更不易识别其结构，所以需要先将细菌进行染色，借助颜色的反衬作用，可以更清楚的观察到细菌的形态及某些细胞结构。微生物的染色及形态结构的观察是微生物实验中十分重要的基本技术。用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发光基团和助色基因的有机化合物。

关键字：简单染色法，革兰氏染色法，细菌的芽孢染色法，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，四联球菌，制片，显微镜的使用，油镜观察

引言：1.学习并掌握油镜的使用方法

2.学习并掌握对细菌进行进行涂片

染色的技术

3.学习无菌操作技术

4.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性

5.学习并掌握革兰氏染色法

6.学习并掌握芽孢染色法

7.了解芽孢杆菌的形态特征，注意观察芽孢的形态、大小、着生位置

原理：

1.简单染色法是用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红等）使其着色。当在中性、弱碱性、弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷。而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

2.革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

3.细菌的芽孢染色法芽孢壁厚、透性差、不易着色，无法用单染色的方法使其着色

用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。

器材与试剂：

1.仪器：显微镜、酒精灯试管、电炉等

2.实验材料：

菌种：枯草芽孢杆菌四联球菌大肠杆菌巨大芽孢杆菌

染色剂：齐氏石碳酸复红染液草酸铵结晶紫染液番红苯酚品红黑墨水

媒染剂：碘液

脱色剂：95%乙醇

操作步骤：

显微镜的使用（主要是油镜）：

1.用前检查零件是否齐全，镜头是否清洁。

2.调节光亮度

3.低倍镜观察：粗调、细调

4.依次再进行中倍、高倍观察

5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。

6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。

7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量洗液（无水乙醇∶无水乙醚＝７∶３）擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的洗液，后将镜体全部复原。

细菌的简单染色法：

染色的流程图：

涂片—干燥—固定—染色—水洗—晾干—镜检

1.先将载玻片洗净，擦干。

2.涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌从斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。

3.晾干：让涂片自然晾干。

4.固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）

5.染色：滴加染液于涂片上，然也刚好覆盖涂片薄膜即可。

6.水洗：倒去染液，用水冲洗，直到流下的水为无色。

7.干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

8.镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

革兰氏染色法

涂片—干燥—结晶紫染色—碘液媒染—水洗—95%酒精脱色—水洗—番红染色—水洗晾干—镜检

1.涂片

2.晾干

3.固定

4.结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；

5.水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

6.媒染：碘液，媒染1min；

7.水洗：用水洗去碘液。

8.脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色10s-18s至流出液无色，立即水洗。

9.复染：滴加番红复染2min；

10.水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。

11.晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。

12.镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。细菌的芽孢染色法

1.制备菌悬液：加10滴无菌水于小试管内，用接种环挑取2-3环菌苔于试管内，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。

2.染色：加苯酚品红染液15-18滴于小试管内，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色8-10分钟。

3.涂片固定：用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。

4.脱色：95%乙醇脱色，直至流出的水无红色为止。

5.水洗

6.复染：用黑墨水染背景

7.镜检：干燥后用油镜观察。

注意事项：

细菌的简单染色法:

1.涂片不可太厚

2.固定时不能在火上烤的时间太长，否则菌体收缩变形

3.染色后必须晾干后才能用油镜镜检

革兰氏染色：

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。

细菌的芽孢染色法:

1.控制好染色时间，不宜过短也不宜过长。

2.注意不要将细菌在制片的过程中损坏。

实验结果：

绘制所观察到的细菌形态（见附件）

讨论：

1.使用油镜时应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作不用说了,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比.

2.要求制片完全干燥后才能用油镜观察是因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.另外,一般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.

3.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌

4.在芽孢染色中，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干可以立刻补加染液，但是效果不事很好。染色只不过是物理过程，要使染色液在高温的时候侵入到芽孢体内，所以，没了染色液可以补加的，不影响染色效果；不过注意的是，一般不让它烘干了再加，原因是染色液会很玻片相粘，待会用水冲不去，那么此时背景事很难和芽孢的染色分得开，影响观察，所以观察效果不好的。

参考文献

微生物学实验（第三版）沈萍范秀荣李光武

微生物学（高教第二版）沈萍陈向东