木犀草素提取物分离纯化

木犀草素提取物的分离纯化

1.材料、试剂与仪器

材料：木犀草素提取物

试剂：无水乙醇、95％乙醇、氯仿、冰醋酸、无水甲醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、浓硫酸、浓盐酸、浓磷酸、氢氧化钠(以上均为分析纯)；AB-8大孔树脂，聚酰胺，木犀草素(98％)

仪器：高效液相色谱仪

2实验方法

2．1初步纯化

鉴于木犀草素在水、乙醇中溶解度不同，采用水沉醇溶法进行初步纯化，除去产品

中糖、蛋白、胶体等水溶性杂质，再进行后续分离。

微波粗提液50摄氏度真空旋蒸成水浸膏一加10倍量蒸馏水洗涤，4800r／min离心取沉淀，重复两次一无水乙醇溶解沉淀物一离心取上清一真空旋蒸近干，取出制成干品备用。

2．2大孔树脂吸附纯化

2．2．1大孔树脂的预处理

大孔树脂AB-8，为弱极性吸附型树脂，选择树脂AB-8先用95％乙醇充分浸泡24h，然后用乙醇洗至洗出液1份加入3份水，无白色浑浊，再用蒸馏水洗尽乙醇，然后转入酸碱处理：用5％HCl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至pH值为中性，接着用5％NaOH溶液浸泡5h，最后用水洗至pH值为中性，此时已经完成装柱。

2．2．2大孔树脂上样溶剂浓度的选择

经过初步纯化的粗品在水溶液中溶解度很小，若采用水浊液上样，大量黄酮由于处

于非溶液状态，而被水大量带出柱，得不到有效吸附，或者沉积在柱顶端，增加柱压。

因而，实验只对30％7,醇溶液、70％7,醇溶液、无水乙醇溶液上样吸附情况进行考察。

吸附率=土苤铲×1。。％

1．上样液的制备：经过初步纯化的样品再次用无水乙醇溶解，在4摄氏度，

8000r／min离心20min，取上清，测定含量后，加水调整成乙醇浓度为100％、70％、30％的上样液。

2．30％乙醇溶液上样

以lmL／min的流速上样，分步收集泄露液，测定木犀草素含量，绘制吸附曲线。

3．70％乙醇溶液上样

以lmL／min的流速上样，样品刚到柱子底部时停止上样。用水洗脱3BV，充分洗

出糖类等水溶性物质。每4mL收集一管，每20mL用分光光度计测定木犀草素的洗出浓度。由于70％乙醇溶液上样时，与柱中的水浓度差比较大，存在热交换，流速过快就会产生大量气泡，影响吸附效果。上样完毕，进入水洗也具有同样问题，因而流速均为1mL／min。

4．无水乙醇上样

首先将柱子顶端的水液放出，使液面高出柱床lcm，将已处理好样液沿柱壁缓缓加

入，同时打开放液阀，使样液缓缓浸入树脂中，避免加样过快，导致柱内热交换剧烈，柱子变花而降低吸附性。．

5．洗脱

上样结束，采用蒸馏水、30％乙醇、70％2,醇、90％7,醇梯度洗脱，分布收集。并考

察70％乙醇的洗脱速度，比较1 mL／min、2 mL／min的洗脱效果。

2．3薄层层析(TLC)

(1)硅胶板制备

含有O．3％羟甲基纤维素钠(CMC．Na)的100mL水溶液加入30g硅胶G，在研钵

中朝一个方向小心研磨至均匀、无气泡的有适当黏度的胶浆，立即涂布于洁净的玻璃板上，鉴定用薄层厚度一般为0.2~0.3mm，制备型厚度为1～2mm。涂布好的薄层板于室温下在水平台上自然晾干，再在105～110摄氏度下烘30min活化，储于干燥器中备用。使用前在反射光和投射光下检查，弃去板面不均匀、有麻点、有破损或已经污染者。

(2)薄层色谱检测：实验中采用板大小规格有2．5×7．5mm，10×20mm两种。

展开剂：氯仿：甲醇：乙酸(V／V)9：1：0．5，以标准品为对照，室温下(23。C)在密闭展缸中展开，浓氨水熏蒸显色，日光和紫外365nm下观察。

(3)样品制备：采用制备型硅胶板(10X20mm)，点样，并以标准品为对照，充

分展开后，刮取与标准品相对应部分的样品点，用无水乙醇溶出，挥去乙醇，重结晶即得到高纯度产品。

2．4萃取．水沉法纯化

水沉醇溶后所得水相部分经测定仍含有较高浓度的黄酮类成分，保持水溶液初始pH4．2，利用乙酸乙酯萃取，萃取过程中由于胶体类成分的存在和水与乙酸乙酯有一定相容性，分层时间较长且容易形成乳化层。试验采用加入一定量食盐的方法减少乳化层，加快分层，每100mL水溶液中加入0．19氯化钠，等体积溶剂萃取两次。萃取液真空浓缩至干，用无水乙醇溶出。乙醇过饱和溶液，按l：2的比例加入蒸馏水，4℃自然沉降取上层液体，1"10加入蒸馏水，4摄氏度静置过夜，离心取沉淀。

2．5高效液相色谱法检测

(1)标准溶液的配制

精确称量木犀草素标准品14．0mg于l0mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，将容量瓶置于超声波发生器中使其充分溶解，定容到刻度，此标准液的浓度为1．4mg/mL。分步稀释到标准溶液浓度为14ug/mL，经0．45um微孔滤膜过滤，滤液供分析。

(2)色谱条件

色谱柱：DiamonsilTM(钻石)C18(5u250×4．6mm)；

流动相：甲醇：0．5％磷酸(V／V)=55：45(使用前超声波脱气20min)；

流速：1．0 mL/min；柱温：室温：检测器：SPD-10AT紫外检测器；

检测波长：350nm；进样体积：10．0uL。