叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定

六. 思考题
6.1 叶绿素、荧光素酶以及绿色荧光蛋白都能产生荧光，它们的原理有什么不同？能量来源有 何差异？
6.2 转GFP的植物在检测绿色荧光时为何没有看到叶绿素的红色荧光?若选择荧光标记绿色植物 细胞,在选择荧光物质时应首先考虑什么问题?
6.3 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类胡萝卜素还是花色素？
叶绿体色素的提取分离及理化性 质的鉴定
一. 实验原理
1.1 叶绿素： 主要包括叶绿素a和b
• 分子式: Chla C55H72O5N4Mg Chlb C55H70O6N4Mg
• 结构式: 卟啉环化合物 四个吡咯环与四个=CH-组成一个 大环,共轭双键形成一个大π键,环中央有一个镁原子,卟 啉环决定叶绿素颜色,也是吸收可见光,并以诱导共振方 式传递光能的根本所在,叶醇尾是由四个异戊二烯单位 组成的双萜
Chla 蓝绿色 Chlb 黄绿色
• 脂溶性: 难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有 机溶剂
卟啉环头部呈极性, 具亲水性; 叶醇尾部具亲脂性
• 皂化反应:
Chla、Chlb 是双羧酸的酯
一个羧基被甲基酯化
可发生皂化反应
另一个羧基被叶醇基酯化
COOCH3
C32H30ON4Mg
+2KOH
COOC20H39
铜。
2.2 仪器和器皿： 分光光度计、台秤、剪刀、 研钵、移液管、漏斗、大试管、层析缸
2.3 材料： 新鲜菠菜叶片，不同颜色的花和果实。
三.实验操作
丙酮研磨提取叶绿素
↓过滤、洗研钵及残渣
↓
↓
2mL丙酮提取液
余下的色素提取液用石油醚萃取
↓
↓↓
↓↓
加入6N HCl
பைடு நூலகம்
纸层析 荧光 皂化反应 光破坏
（脱镁叶绿素）
COOK
C32H30ON4Mg
+CH3OH+C20H39OH
COOK
• 取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2 +取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色
•光学特性：
（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收 变化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640——660nm 红光部分 叶绿素特有 410——470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有
（2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射
光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内
放出暗红色的光。 寿命长（10-2秒——10-3秒）
1.2 类胡萝卜素
类胡萝卜素 胡萝卜素 橙黄色 不溶于水 叶黄素 鲜黄色 溶于有机溶剂
↓
↓
分离色素
Cu取代
↓
扫描光谱
花色素实验
四. 结果与分析
• 对实验现象作好详细记录， 并加以解释 • 请对皂化反应现象做出合理解释，而不是单单用反应方程式来表示
五. 注意事项
• 实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远离火源。 • 研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅。 • 过滤时不要使用滤纸而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松紧适当。 • 叶绿素要避光保存。
• 根据三碳桥的氧化程度可分为：
花色素苷：呈现颜色。紫色锌化物、红色的碱盐、无色化合物
黄酮
防御伤害。 存在于花器官和绿叶中。
黄酮醇 紫外光保护剂，吸收UV-B，避免细胞受到伤害。
异黄酮 功能多样。鱼藤酮杀虫，植物防御素抑制微生物。
• 花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。 • 颜色受多因素影响：
• B环上羟基和甲氧基数目 羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝 羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红
• 芳香酸对主要骨架的酯化 • 液泡中pH值 酸红碱蓝 • 营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累
不同花色素的取代基和颜色
花色素
3’
4’
花葵素
-H
-OH
花青素
-OH -OH
花翠素
-OH -OH
芍药素
-OCH3 -OH
甲花翠素 -OCH3 -OH
二甲花翠素 -OCH3 -OH
5’ 颜色 -H 橙红 -H 紫红 -OH 蓝紫 -H 玫瑰红 -OH 紫 -OCH3 紫红
二. 试剂与材料
2.1 实验试剂： 石油醚（沸程60℃∽90℃）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸
• 分子式、结构式： 胡萝卜素：C40H56 有α、β、γ三种同分异构体 叶黄素是胡萝卜素的衍生物，其两端的紫罗兰酮环 第四位C上的H被OH取代，分子式为C40H56O2
• 类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸收的光 能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不 被氧化或阳光破坏
1.3 类黄酮类