抗体制备技术的发展及其医学应用

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1 抗体的发展

抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。

免疫血清学研究阶段

免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用

已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。

单克隆抗体研究阶段——杂交瘤技术的诞生

淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。试验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。

这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

基因工程抗体技术研究阶段

自从第一个单克隆抗体产生以来, 单抗已广泛地应用于疾病的诊治上。然而长期以来, 临床上使用的单抗多为鼠源性单抗, 存在着很大弊端, 最突出地表现在其异源性异质性所引起的人抗小鼠抗体反应或超敏反应, 一方面降低了单抗的效价, 另一方面又会给病人带来严重的后果。因此, 对鼠源性单抗进行改进以及人源性单抗的研制成为单抗研究的主要方向。为了克服传统的鼠源性单抗存在的弊端, 随着分子生物学和细胞生物学的快速发展, 单克隆抗体的制备技术取得了比较大的进展, 包括对鼠源性单抗的改造、人源性单抗的研制及对抗体分子结构和功能的改造, 尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因转染色体小鼠技术为代表的人源性单抗制备技术的研制最为瞩目。

1）人鼠嵌合抗体和重构型抗体

指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。1984 年报道研究出了人-鼠杂交瘤的构建方法, 并在1987年进行了第1次临床试验。临床研究表明,嵌合抗体的副反应轻，产生人抗鼠抗体(HAMAs)反应率较鼠源性单抗低，而且在体内的半衰期也比相应的鼠单抗长6～8倍。现已制备出大量抗结肠癌、乳癌、B 及T细胞恶性肿瘤的嵌合抗体，主要是针对肿瘤相关抗原。 1997 年Rituxan 和Herceptin在美国相继获准用于临床肿瘤治疗，Rituxan是以B细胞的CD20分子为靶点的人鼠嵌合抗体，对非霍奇金 B 细胞淋巴瘤有疗效。 Herceptin是抗HER-2 /neu癌基因编码蛋白的单抗，临床研究表明对乳腺癌有效，与化疗药物联合则有更显着的疗效。表皮细胞生长因子受体( EGFr)在人鳞癌、乳腺癌和脑