企业诊断-现代分子诊断技术 精品

Scanner
Analyze data
基因诊断的原理
❖ 利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA 水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从 而对疾病做出诊断的方法
❖ 策略 检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的的致病基因 检测表型克隆基因
基因治疗的机理
❖ 基因置换：正常基因取代致病基因 ❖ 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 ❖ 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能 ❖ 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达 ❖ 基因封闭：封闭特定基因的表达 ❖ “自杀基因”的应用 ❖ 免疫基因的治疗 ❖ 耐药基因的治疗
第二节 DNA诊断系统
❖ DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学 特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作 为专一性的诊断标记
一、核酸杂交
1、工作原理： ◆ 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成 氢键
2、3个关键要素： ★ 探针DNA ★目的DNA ★ 信号检测
主要依据： 碱基互补、变性和复性 碱基互补 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性：
速度慢、花费高，寄生虫 可能难以进行体外培养， 且必须使用动物材料
简单、快速、能够实现自 动化，可用于检测大量的 样品
无法区分活的寄生虫与处 在潜伏状态的寄生虫。有 时会有非特异反应发生
快速灵敏，能够实现自动 化，可以分辨不同种的寄 生虫，不需要以前有寄生 虫感染病史
花费高，步骤多，无法区 分活的和死的寄生虫，有 时会有假阳性或假阴性
织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化 DNA ❖ 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的 序列扩增，再进行杂交检测
从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用 于对所有的致病微生物的检测
4、非同位素标记探针
❖ 32P的缺点：
⑴半衰期短，仅13天 ⑵操作起来比较危险 ⑶必须要有特殊的实验室设备进行操作 ⑷放射性垃圾的处理繁琐
诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、朊病毒
检测寄生虫感染的诊断方法的比较
方法
显微镜镜检
体外培养、接种 抗体检测 DNA杂交及PCR
优点
缺点
简单易行，可直接观察到 寄生虫的形态
能检测到活的寄生虫，并 可检测感染性和感染程度
速度慢，灵敏度低，对经 验水平要求高费时费工， 无法辨别形态相近的寄生 虫
❖ 非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学
发光物质而达到放大信号的目的 ❖ 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的
方法制备探针 ❖ 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年 ❖ 检测发光和颜色变化可在几小时内完成
生物素 B
探针Hale Waihona Puke Baidu
目的DNA
B
加入链霉素抗生物蛋白
由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术 如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相 支持物，所以称为DNA芯片技术
DNA芯片技术原理
❖ 大规模集成的固相杂交
❖ 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA 双链碱基互补配对、变性和复性的原理
以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息
第七章 现代分子诊断技术
❖酶联免疫吸附测定 ❖DNA诊断系统 ❖DNA指纹 ❖遗传性疾病的分子诊断技术
基因诊断
基因
蛋白质
性状
基因 诊断
生化 诊断
临床 诊断
❖ 传统的诊断程序
先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的 生理学特性
确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌， 还是其他物质
实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比 较特异
产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光 的强弱就代表了模板的数量
上游
引物
R
5′ 3′
R 5′
3′
Q 3′ 5′
下游 引物 Q
3′
5′
TaqMan探针的荧光信号产生机制
例一：疟疾的分子诊断：
❖ 检测是否存在疟原虫
1. 抽取血样进行镜检 2. 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体
无法区分是以前感染还是现在感染
一、酶联免疫吸附测定的原理
工作原理：
❖ 主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合 ❖ 假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于
检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体
二、检测过程：
①将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定 板）上
加入生物素标记的碱性磷酸酶
B
B AP
加入不同的生色或化学发光底物
B
B AP
荧光标记的引物直接进行PCR检测
引物1
DNA
PCR
引物2
荧光染料
层析
荧光检测
游离引物
❖ 分子夹心探针检测
分子夹心探针 (没有荧光)
荧光团
猝灭剂
与目的DNA杂交
发出荧光
目的DNA
TaqMan探针技术
❖ 原理： 利用Taq酶的3′ 5′外切核酸酶活性，切断探针，
谢德尔，1999
分子诊断
利 用 PCR 技 术 或 PCR 与 分 子 杂 交 标记相结合，可 以快速准确地检 测出病原性物质。
分子诊断
遗传性疾病的诊断
羊水和胎盘绒毛膜检测
第一节酶联免疫吸附测定
❖ 抗体高度特异地与抗原分子结合 ❖ 通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)
❖ RNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays
❖ Protein Western blot, Immuno-histochemistry,
microarray
Southern blot
NTTNT T
N
FISH
PCR 技术
DNA 测 序
DNA芯片技术的概念
指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将 大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面， 然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得 出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）
④加入无色底物
双抗体夹心法
❖ 检测大分子抗原
间接法 ❖ 检测抗体
竞争法 ❖ 测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体
双夹心法
❖ 测定大分子抗原
特
异
性
相
同
，
来
源
不
同
3、使用多克隆抗体的缺点
①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备 的抗体的量之间也会有差异
②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之 间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分， 因为在ELISA检测中都会发生颜色变化
在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性：
随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补 双链
核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段
预杂交
制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
3、杂交探针
❖ 必须是高度特异性的DNA片段 ❖ 种级探针：区分两个或多个物种 ❖ 亚种级探针：区分物种内特定的株系 ❖ DNA ❖ RNA ❖ 化学合成或克隆的完整基因 ❖ 基因的一个片段
二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术
❖ 抗生素的不合理使用 ❖ DNA杂交 ❖ PCR检测 ❖ 噬菌体介导
DNA杂交
❖ 设计16SrRNA为探针 ❖ 16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守
性 ❖ 特异性不是很好 ❖ 必须结合PCR技术
PCR检测
❖ nested PCR
❖ 针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引
例二： 锥虫的检测
❖ 锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经 系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞
❖ 显微镜检新鲜血液 ❖ 取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后
杀死昆虫,镜检昆虫的肠道 ❖ 免疫检测:假阳性高
❖ PCR检测 ❖ 针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计
引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到 188bp的条带
美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨 酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是 世界上第一个基因治疗成功的范例
1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁 女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因 有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全， 只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这 种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的 基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。
❖ 单克隆抗体特异性强
只结合抗原上某一单一位置
4、酶联免疫吸附测定的局限性
❖ 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能 作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须 进行western检测
❖ 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特 异性
❖ 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位 点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方 式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结 合
❖ 分离杂交探针的方法：
1. 提取某一病原微生物株系的染色体DNA 2. 限制性内切酶进行酶解 3. 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 4. 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性
微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选
❖ 核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 ❖ 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组
❖ 灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需pg水平
❖ 稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需 处于活性状态
❖ 诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态
❖ 临床应用前景好
基因诊断优点
❖ 从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制 ❖ 显著提早产前诊断的时间 ❖ 无需对组织、器官或细胞进行选择 ❖ 快捷准确、安全
②加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗 （primary antibody）,反应后冲洗，将未结合上的 一抗洗去
③加入二抗（secondary antibody），二抗通常只特 异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着 一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这 些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有 色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未 与一抗结合的二抗洗去
❖ 现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分 子生物学的方法对病原物质进行诊断检测
❖ 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分
子产生阳性反应 2、灵敏度(sensitivity)高 3、操作简单(simplicity)
基因诊断的特点
❖ 特异性高 检测目标是基因，为原始的致病因素
DNA芯片技术流程
arrayer
microarray
Biological Sample
❖ Microarray fabrication ❖ Sample preparation ❖ Molecular hybridization ❖ Detection and analysis
“Hybridize”
利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理， 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在
核酸探针
是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列
探针标记物
有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 荧光素等）两大类
3. DNA杂交诊断
❖ DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列 ❖ 具体的分离过程： 1. 构建一个疟原虫的核基因文库 2. 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库 3. 选出那些杂交信号最强的克隆 4. 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中
不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作 为DNA探针的可靠性
基因诊断常用的技术
• 核酸分子杂交 • PCR（聚合酶链式反应） • 限制性酶切分析 • SSCP（单链构象多态性分析） • DNA 测序 • DNA 芯片技术
❖ DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing,
micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP