实验三、药物敏感性实验

实验三、药物敏感性实验

对于一种病原微生物来说，往往有多种抗菌素对其具有抑制作用，比如对于炭疽杆菌、猪丹毒杆菌、链球菌以及葡萄球菌等革兰氏阳性菌来说，对其有效的有青霉素类（阿莫西林、氨苄青霉素）、大环内酯类（红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素等）。对于像大肠杆菌、布氏杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌来说对其有效地抗菌素如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素。但在实际上，由于人类对抗生素的大量使用甚至是滥用，导致了细菌产生耐药性，并且这种趋势正在逐渐加大，细菌作为自然界中的生物与其它种类一样也存在生存的竞争，举例（动物园中的羚羊，在没有天敌存在时体质和繁殖率较弱，当存在天敌时，体质弱的被淘汰而好的生存下来），细菌也一样在不断改造自己来适应环境，比如基因变异等，人类发现新药物的速度远远赶不上细菌的变异速度，因此对于人类来说这种形式比较危急，大家想想这几年几次疾病大流行就可以感觉到了，象非典、禽流感、最近新出现的71号病毒导致的手足口病等。细菌产生耐药性后一些理论上有效的抗生素就不管用了，因此必须通过药物敏感性实验来选择对其敏感的药物。

值得注意的是由于各地区对于同一种病原所用抗生素种类有所差异，因此可能导致不同地区同一种细菌的耐药性往往不同，因此，在临床治疗中要根据不同情况不同对待。

在临床应用中药敏试验还有另外一个重要的意义，当动物发病比较急、死亡率非常高并且不能立即诊断，不知道具体的病原就无法正确的用药，在这种情况下，为了尽快的止住病情以减少损失，往往来不及对病原进行鉴定，而是分离培养后直接进行药敏实验，选择效果好的药物马上予以治疗。

滤纸片扩散法：（简介作的过程）

1.含药滤纸片的制备：

滤纸片：用打孔机将滤纸打成直径为6毫米的圆纸片，121摄氏度高压灭菌。

药液配制：一般针对药物性质及单位含量不同其配制方法不同，方法根据规定的标准进行，有的药物用水稀释即可（如氯霉素、红霉素、卡那霉素），但有的药物则需用缓冲液（青霉素、链霉素、庆大霉素），还有的需要用强酸（磺胺药物）或强碱（呋喃西林）来溶解，并且药物浓度也各不相同。

将灭菌的滤纸片用无菌的镊子摊布于灭菌的平皿中，每100片加药液1mL，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，在37摄氏度温箱中烘干，时间不宜过长，以免某些抗菌药实效。之后贮存于青霉素小瓶中，放置于冷暗干燥处，备用。

2.培养基的选择

药敏试验最好用专用Mueller- Hinton 培养基，有商品化试剂出售，本培养基对抗菌素抗菌效果影响最小。对于营养要求较高的细菌可加入0.5%的绵羊血、血清、糖类以及酵母提取物等。例如，链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板；对磺胺类药物应选用无蛋白胨平板，含血培养基不能用于磺胺类药物的药敏试验；一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂。应注意常见的许多药物可以受到各种离子的影响而导致药效降低，所以培养基的配制要用无离子水和高品质的琼脂。培养基越厚抑菌圈越小，适宜的厚度为3~4 mm，直径为90 mm 的培养皿倒入25 ml 琼脂为宜。

3.菌液制备

从患病或死亡动物病灶处分离细菌，进行培养后挑取目的菌单个菌落接种到液体肉汤培养基中进行摇床培养，对于一般的细菌培养6个小时即可达到药敏试验所需浓度，而对于生长较慢的细菌如链球菌、肺炎球菌等一般培养18小时才能达到所需浓度。

4.实验方法：

（1）、用无菌的棉拭子，沾取少量菌液，均匀地涂布于合适的培养基上，也可以用无菌吸管取0.5~1ml菌液加到培养基上，用曲玻棒涂布均匀；室温放置5min，待稍干后，再放含药纸片，用无菌镊子将各种药敏片分别平贴在平板培养基上，每一个平板大约可以贴4～6种药敏片，纸片之间应保持一定的距离一般应距离24mm。贴纸片时位置一定要安排适中，防止出现抑菌圈重叠。贴纸片时可轻压，以保证与培养基密切接触，纸片贴上后不可以再移动，因为抗菌素会自动扩散到培养基内。

（2）、放置于37摄氏度培养8～12小时，观察结果。

4.药敏试验结果判定

观察含药纸片周围有无抑菌环，并量其直径（包括纸片直径）大小，用毫米为单位记录。抑菌圈直径在20 mm 以上为极敏，15~20 mm为高敏，10~14 mm 为中敏，10 mm 以下为低敏，0为不敏。极高、高敏，以该抗菌素的适当剂量治疗试验菌株所引起的感染有效；中敏，表示试验菌株对该种抗菌素的较高剂量才有敏感性；不敏，该抗菌素的治疗剂量完全不能抑制试验菌。

在比较紧急的情况下，可以进行简易的药敏实验。

简易药敏试验方法：取病死畜禽部分肝脾等组织，按1:5加生理盐水研磨制

成悬液，静置5min后，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5min后将药敏试纸紧帖于标记好的琼脂板上，药片间距3cm以上，置37℃培养每隔6h观察1次，12-24h判定。抑菌圈大的即为该病原菌对这种药物的敏感性强，对病畜禽即选用这种药物治疗。

5.注意事项

1 一些抑菌性药物的抑菌圈外围常不会显示完全抑制面而产生不明显生长，也要以外围界限进行测量。

2 若抑菌圈内存有清晰的菌落，则该菌落可能为抗药性变种或其他不同细菌，如果证实该菌落为抗药性变种，即使有很大的抑菌环，也视为抗药。

3 实际操作中有时会出现药敏试验结果与临床治疗结果不符，最常见的原因是分离的细菌不是真正的致病菌，而对一些营养苛求的致病菌也易出现这种误诊。所以通过流行病学调查、病理检验以及实验室检查做出综合判定后，再进行药敏试验是非常必要的。

在检测过程中, 会出现2 种不同现象干扰结果的判读。①抑菌圈外围长满厚苔, 抑菌圈内又长一层薄薄的细菌层, 虽与抑菌圈外反差大, 界限明显, 但结果不好判读, 这往往是因为分离的致病菌中污染有多种其它微生物。②细菌生长不成片, 有部分无细菌生长, 抑菌圈周围界限不明显, 或菌圈形状不成圆形, 难以测定抑菌圈大小, 这种现象多数是致病菌量太少造成, 一般90 mm 直径的培养皿用1 ml 菌液量就够, 菌液浓度一般用肉眼观察比较混浊即可。