5 第五讲 分子克隆载体

3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合 成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
含四个部分：
MCS
lacZ`
Ampr Ori
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）； （2）ampr ;
（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶
基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列；
（4）多克隆位点（MCS）
pUC18
pUC19
Insert
Lac Z`
Lac Z`
ampr
No insert
pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列 已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。 含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基 因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。 将质粒pSF124中含ampr 基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr 基因的DNA片段同含ColE1复制起始点(来源于 pMB1 、 松 散 型 ) 的 DNA 片 段 重 组 ， 构 建 成 质 粒 克 隆 载 体 pBR322。
（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌 素基因）；
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达40kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA的构建。部分柯斯质粒的基本特性
人工染色体载体
(artificial chromosome vector)
质粒的基本性质： 1 复制
按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分 为: 1）严谨型质粒(stringent plasmid) 拷贝数少，为1～5个 2 ）松散型质粒(relaxed plasmid) 拷贝数多，可达10个拷贝以上
某种质粒属于严谨型或是松散型的，与 宿主有一定的关系。 例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属 于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型 的。 一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含 有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝 数的基因。
3 建立重组λ DNA分子的体外包装系统 在实验室重组的λ DNA分子，必须经过体 外包装成噬菌体颗粒后才有效地感染受体细胞。 λ噬菌体突变株D-和E当两个突变株分别感染受体细胞时，两者 都可复制λ DNA，但不能把复制合成的λ DNA 包装成噬菌体颗粒。二者蛋白混合，能有效地 包装。
λ噬菌体的主要类型
溶菌途径：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插 入染色体DNA，经过一段时间的潜伏期，就大 量增殖新的病毒颗粒，使宿主细胞破裂，释放 的病毒颗粒又感染其他细胞。（左图示）
溶源途径：感染宿主细胞后，其DNA与宿主细 胞染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其 他细胞的能力。（右图示）
λ噬菌体的生长途径
作为克隆载体的DNA分子具备的条件： 1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞； 2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）； 4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因； 5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
裂解循环
溶源态
λ噬菌体的基因组分区
左区：Nul基因—J基因之间的基因 其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒 的形成。
λ噬菌体的基因组分区
中区：J基因右边—gam基因之间的基因 溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要 的基因。（外源DNA片段的插入）
λ噬菌体的基因组分区
右区：gam基因右边—Rz基因之间的基因 主要用于噬菌体的复制和裂解宿主菌。
多克隆位点
MCS
复制起始点
ori
Ampr
遗传标记
克隆载体
按功能分： 克隆载体
表达载体
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。 一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
（为什么？）
pUC质粒
pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的；
包括pBR322的ampr基因；
缺乏控制拷贝数的rop基因。
pUC的主要优点：
（1）分子量更小，仅为268的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。
（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ， 可利用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切 位点构成。
选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
(3)四环素抗性基因 （tcr tetr）
(4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr)
(5)新霉素抗性基因（neor）
pBR322
质粒的存在形式： 一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。 也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小 质粒 宿主 pPbs 蓝藻 CoLE1 大肠杆菌 PV21 三叶草根瘤菌 多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆 子的标记基因。 4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。 5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中 组装各种元件，构建成不同用途的质粒克 隆载体。
质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒 的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分 别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
构建质粒载体的基本原则
5 在能达到预期目的的情况下，构建过程要 力求简单。
构建质粒克隆载体的基本策略
1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受 体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克 隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝 数。 2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源 DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点 应尽可能多。
1 插入型载体(insertion vector):
通过特定酶切位点允许外源DNA片段插 入的载体。外源DNA片段大小0～ 6 kb。 2 置换型载体(replacement vector): 允许外源DNA片段替换非必须DNA片段 的载体。外源DNA片段大小9～23kb。
插入型载体
主要用于cDNA克隆，允许插入的外源 DNA片段大小为0～6kb。基因cI内的E.coRI 位点作为唯一位点，可以用于外源DNA的插 入。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
DNA ligase
重组体 载体自连
目的基因 自连
基因操作的基本步骤
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。
人工染色体载体： 利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
ampr
Insert
Blue
White
λ噬菌体载体
（lambda phage vector）
把感染细菌的病毒称为噬菌体。 病毒主要有DNA（或RNA）和外壳蛋白组成。通过感 染，病毒颗粒进入宿主细胞。
T2噬菌体结构示意图
λ噬菌体的性质
1 λ噬菌体由λDNA和外壳蛋白组成。
2 在噬菌体中DNA是线性的，全长48502bp，左右各有 12个核苷酸组成的5’凸出黏性末端，而且是互补的。 5‘GGGCGGCGACCTNN……..NN3’ 3’NN……CGCCGCTGGA5’ 把此末端称为 COS位点(cohesive end site) 3 其有50个以上基因 4 有56种限制酶识别位点 5 生长途径有溶源途径和溶菌途径。
普通型载体pBR322的结构图
HindIII BamHI PstI SalI ScaI Amp
r
pBR322
(4.36 kb)
ori
pBR322
如何筛选？
利用Tetr基因内部的BamHI位点来插入外 源DNA片段，可以通过插入失活进行筛选。 BamHI G/GATTC
经重组DNA分子转化处理的受体菌在不 含标记药物tc的琼脂培养基上培养，则含或 不含重组DNA分子的受体菌都能长出菌落。 然后取菌落的一部分接种在含tc 的琼 脂培养基上，不会长出菌落的原菌落才是 真正在tcr基因区插入外源DNA片段的克隆 子。
构建质粒载体的基本原则
1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等………..
构建质粒载体的基本原则
2 正确获得构建质粒载体克隆元件 一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获 得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的 切割位点既要保证元件完整无缺，又要使 DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必 要的序列，使构建的载体尽可能小。