第三章原核生物分子克隆载体
《分子克隆载体》PPT课件 (2)
基因)lacz’基因。
6
但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
精选ppt
20
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
精选ppt
15
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
精选ppt
9
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
精选ppt
10
以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
精选ppt
16
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)：
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
精选ppt
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
第三章原核生物分子克隆载体
第三章原核生物分子克隆载体第三章分子克隆载体§3.1 质粒载体质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。
除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA 可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
一、质粒的一般特征1.质粒DNA编码的表型质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；2.质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
②质粒DNA的转移过程质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移3.质粒DNA的复制类型根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒(stringent plasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝；②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。
分子克隆载体
分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程复习重点
基因工程期末复习第一章：基因工程1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。
2. 基因工程研究的主要内容或步骤：基因克隆的通用策略：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。
①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
3.三大元件：载体、质粒、片段。
第二章：分子克隆工具酶1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。
2、限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。
三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶）3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA 不被相应的限制酶所切割。
三种（）4、回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。
5、同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。
同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。
但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
6、同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
7、影响核酸内切酶活性的因素：①DNA浓度②DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37度）④DNA的分子结构。
分子克隆载体 ppt讲义转pdf
UUUU...…
RNApol RNA pol
5¢ 5 ¢ 3¢ 3 ¢ 3¢ 3 ¢ 5¢ 5 ¢
5´pppG 5
茎环结构使转录终止的机理 茎环结构使转录终止的机理
一、pBR322
调控序列
增强子 启动子
结构基因
UAS 酵母
TATA
核糖体结合位点（S-D序列）
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
表达体系的发展
表达体
第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 第三代 哺乳类细胞表达体系 第四代 基因直接导入
载体
质粒、噬菌体 穿梭质粒 病毒、脂质体 DNA本身
宿主
细菌 酵母 培养细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结 合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修 饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知 识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
P
O
Z Y X
诱导物 诱导物
乳糖(或IPTG)
P O
Z Y X
Am
lacZ
N H 2
COOH
a片段 片段
w片段 片段
lacZ
标志补救（ß-半乳糖苷酶法） ß 半乳糖苷酶法）
基因工程复习资料
基因⼯程复习资料⼀、绪论1、简述基因⼯程的概念。
答：基因⼯程是指按照⼈们的设计，⽤⽣物技术直接操作⽣物的基因组。
通过分离和拷贝⽬的基因或⼈⼯合成外源基因，在体外将外源基因插⼊到载体分⼦中，成为重组DNA，再导⼊宿主细胞内，进⾏扩增和表达。
此过程所涉及的⽅法学称为重组DNA技术，也称分⼦克隆或基因操作。
2、列举基因⼯程中常⽤的⼀些技术。
答：（1）基因敲⼊：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利⽤靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。
（2）基因敲除：将⼀个特地设计的DNA⽚段导⼊⽣物体中，通过同源重组使靶基因被置换出⽽失活的实验技术。
（3）基因敲落：是⽤反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。
（4）基因打靶：是⽤同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。
（5）基因组编辑：⽤基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活⼦样效应物（TALE）和成簇间隔短回⽂重复（CRISPR）进⾏剪切。
⼆、基因⼯程的分⼦遗传学基础（⼀）名词解释1、基因表达：指DNA分⼦经转录产⽣互补的RNA分⼦。
2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的⼦代DNA分⼦的核苷酸序列均与亲代DNA分⼦相同，但⼦代DNA分⼦的双链⼀条来⾃亲代，另⼀条为新合成的链，故称为半保留复制。
3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。
半不连续模型是DNA复制的基本过程。
4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从⽽使核酸的天然构象和性质发⽣改变。
变性DNA常发⽣⼀些理化及⽣物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发⽣改变、增⾊效应。
5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的⼀种逆转过程。
热变性DNA⼀般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退⽕”。
原核生物分子克隆的宿主和载体系统
二、乳糖操纵子
利用β-半乳糖苷酶及其基因 β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal
形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中 β-半乳糖苷酶的活性。
6
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白
诱导剂 IPTG
β-半乳糖苷酶-
α-肽段
分解半乳糖
➢ 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA 的合成 。
17
问题：在寄主复制后，质粒是如何分 配到子细胞中？
Par原件会附着在细胞膜上，随着细 胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中， 维持相对稳定的质粒拷贝数。
18
第二节 质粒载体
四、相ห้องสมุดไป่ตู้性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关 系密切的不同质粒，不能够在同一寄主 细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒 的不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒 称为不亲和质粒
3
二、乳糖操纵子
A) lac operon结构以及表达特性
lac Z: β -gallactosidase (β-半乳 lac I: 乳糖阻遏蛋白基因
糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）Plac :乳糖代谢结构基因的启动子
lac Y: lactose permease（半乳糖苷
透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)
30
31
32
二、基于λ噬菌体的克隆载体
1、对野生λ噬菌体的改进
A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的 RNA探针的载体 E、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶 形成融合蛋白的载体。
基因工程第三章分子克隆载体
二、载体的报告基因(标记基因)
基因工程中利用载体上特意引入的一些具有特殊标志意 义的基因，用来证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目 的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。这 种具有标志意义的基因称为报告基因(report gene)，或标记 基因。
由于基因工程多用质粒作载体，质粒的报告基因在DNA 重组工作中具有重要意义，通过质粒的报告基因的表达可使 宿主细胞呈现一些可观察到的细胞生物学待征，通过质粒赋 予细胞的表型可识别和筛选重组体DNA的转化子细菌。
连接
切酶切割之后，发生双链断裂而形
成线性DNA(IDNA)，通称L构型(a) 。
质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借 居”
宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响， 宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。
①α-互补
是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整 的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互 补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实
现功能互补而建立的。
质粒
载体
N
②插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具
有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两 种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基 因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素 是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
3分子克隆载体
顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
何水林版基因工程第三章分子克隆载体PPT演示课件
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
1质粒的基本特性 1.1 质粒DNA的构型
两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构， 称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常 呈现超螺旋的SC构型
只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称 为开环DNA（ocDNA），此即OC构型
线性分子DNA（IDNA），称为L构型
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
How many copies can be
? replicated
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
answers
Repressor model: cop factor
Negative control Antisense RNA model: RNAⅠ
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
1.2 质粒DNA分子大小
质粒 pPbs ColE1 ColV2
Ti PV21
F
宿主 蓝藻 大肠杆菌 大肠杆菌 致癌农杆菌 三叶草根瘤菌 大肠杆菌
分子大小/kb 1.5 6.4 140
330左右 700 94
பைடு நூலகம்
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
pBR322 4363 bp
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
按功能分类
克隆载体 （cloning vector）对目的基因克隆，建立DNA 和cDNA，其上有复制子即可
表达载体 （expression vector）
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
【期末复习】基因工程期末考试重点知识整理
基因工程期末考试重点知识整理基因工程第一章基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)基因工程(Gene Engineering),是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.2、基因工程的历史基因工程准备阶段:1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人:Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生:1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件:一系列新的基因工程操作技术的出现;各种表达克隆载体的成功构建;一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现3、基因工程的内容(P9)4、基因克隆的通用策略(P12)(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)第二章分子克隆工具酶5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)概念:一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点(参加PPT)命名: 依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如:从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind ?，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，?表示序号。
分类:依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为:?型酶、?型(?s型)酶和?型酶。
真核细胞中有4中DNA聚合酶:α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶:?，?，?6、几个基本概念粘性末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。
第三章 分子克隆的载体
3
载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 有合适的选择标记，易于筛选。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
11
一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
12
✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA 水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
25
✓ 筛选标记基因 主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外
源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通 过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重 组质粒。
α-互补 插入失活
26
α-互补
α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变
体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体 之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
37
38
2）pUC18/19质粒载体
• 来自pBR322 • 拷贝数 2000 - 3000 / cell • 装有多克隆位点（MCS）
基因工程第三章克隆载体
*
λ 噬菌体的侵染
8/31
*
（1）切去λDNA的中央片段
BamHI sites
Left arm
Right arm
COS
COS
BamHI
COS
COS
L
R
COS
COS
L
R
回收
9/31
*
1.2、λ噬菌体载体的构建
10/31
插入标记基因（marker gene） 例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上表现篮色.
添加标题
01
GFP gene
添加标题
02
Multiple cloning sites
添加标题
03
AMP
添加标题
04
r
添加标题
05
26/31
添加标题
06
*
二、诱导型表达载体：
启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。 外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。 优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。
*
1/31
第二节 病毒载体 virus vector
噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期
2/31
天然的转基因过程
*
1. λ噬菌体克隆载体
λ 噬菌体（Bacteriophage lambda） 头部 尾部 尾丝 3/31
*
1.1、λ 噬菌体的性质
线状，双链DNA， 48502bp
cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。
1
定位整合效率
2
19/31
3
*
第四节 YAC克隆载体
用于基因克隆的载体
卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。
iv）链霉素（Streptomycin，Str）
a）杀菌原理：通过与30S核糖体亚基结合，导致mRN A错译。杀死细菌。
b）细菌抗性原理： Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶
对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。
通过接合转移。
pBR322 4363
Amp Tet
pBR322
插入片段
T平板
3.2.8.2 pUC18 / 1 9：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相 容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的质粒，复制时受各自 拷贝数控制系统的调节，使两种质粒的最终拷贝 数恒定，经过若干复制和细胞分裂周期后仍能共 处同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，复制时 受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种 质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒 在以后的细胞分裂周期中更具优势
青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理：通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理： Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地
使氯霉素乙酰化而失活。
iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第三章分子克隆载体§3.1 质粒载体质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。
除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
一、质粒的一般特征1.质粒DNA编码的表型质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；2.质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
②质粒DNA的转移过程质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移3.质粒DNA的复制类型根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒(stringent plasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝；②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。
一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，它的复制不仅受自身的制约而且还受到寄主的控制4.质粒的不亲和性①定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。
注意：只有当有确切的证据表明第二种质粒B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。
②不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。
同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近，以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不亲和pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不亲和p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不亲和③质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*ⅰ. 负反馈调节环(negetive feed-back loop)：大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。
当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。
当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。
ⅱ.同一个细胞含两种相容质粒，由于亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。
于是这两种质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。
*ⅲ.同一细胞含两种不相容的质粒，亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。
这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。
*ⅳ两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。
因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质)浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉)。
二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制1．ColE1质粒DNA复制调节的机理许多的质粒载体都是由ColE1质粒派生的。
ColE1质粒的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环型DNA单向进行。
RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1 DNA 转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。
由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。
RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小分子量的RNA分子，它通过干扰RNAII分子的加工而抑制质粒DNA分子的复制。
RNAII也是由ColE质粒DNA编码的另一种小分子量的RNA分子，并在复制起点形成RNA-DNA杂交分子。
RNase是一种核酸内切酶，它切割RNAII分子释放出3 -OH作为DNA聚合酶I催化的DNA复制的引物。
所以控制ColE1质粒复制的关键点就是在复制起点形成RNAⅡ-DNA双链分子，而它的关键步骤却是由RNAⅠ控制。
ColE1的复制同样也受一种RNA调节剂Rom的控制，它可以使RNAI和RNAIIII之间的碱基配对作用保持稳定，从而阻止RNA Ⅱ与模板DNA杂交2．质粒复制控制的分子模型目前公认的阐明质粒复制控制机理的分子模型有两个:自体阻遏蛋白质模型:核心是阻遏蛋白质的合成受负反馈调节机理调节。
关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负反馈机理调节，而且其浓度是恒定的。
抑制蛋白质稀释模型:阻遏蛋白质是组成型合成,其浓度同质粒的拷贝数成正比。
关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。
①抑制蛋白质稀释模型质粒DNA的复制是受一种由质粒编码的抑制蛋白Cop调控的。
Cop蛋白质的浓度同质粒的拷贝数成正比。
它通过两种途径质粒的复制：一种是通过同质粒DNA的复制起点(ori)结合，直接抑制质粒复制.另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。
一般认为,单体状态的Cop蛋白质是没有活性的，当处于多体状态时，才具有活性，而这两种蛋白之间的平衡,取决于细胞中抑制蛋白质自身的浓度。
由于细胞在生长过程中体积不断增大，蛋白浓度下降,形成单体形式，失去抑制作用，质粒拷贝数增加。
但由于拷贝数增加抑制蛋白编码基因数目也随之增加到一定程度又导致质粒复制受抑制。
②自体阻遏蛋白质模型质粒的复制是由起始蛋白Rep引发的,该蛋白是复制启动作用的限速因子.它的浓度决定着每个细胞每个世代的质粒的最终复制总数. Rep蛋白编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子,共转录成同一个mRNA分子.自体阻遏蛋白同启动子-操纵子区(P/O)的结合作用,调节质粒的转录,以维持细胞中Atr和Rep蛋白处于恒定的水平.,而由Atr蛋白调节产生的Rep蛋白,则是通过同复制起点(ori)的结合来引发质粒复制.另一种解释是Rep蛋白具有双重功能,既具有自体阻遏蛋白的功能,也可同(P/O)的结合抑制转录,又具有起始蛋白功能,引发质粒复制.三、质粒DNA的分离与纯化1．氯化铯密度梯度离心法原理：由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA 与其寄主染色体DNA区分开来，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。
实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过程中，大分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。
氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体DNA与质粒DNA在高级结构上的差别(或说是异质性)而分离纯化的技术。
在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了1-1.9052g/cm3的连续的浮力密度梯度。
已知大肠杆菌寄主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌寄主染色体DNA和RNA等4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在CsCl连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的。
缺陷：尽管氯化铯-EtBr密度梯度离心法可以得到高纯度高质量的质粒DNA，但是操作复杂，且需要昂贵的氯化铯和超离心设备，并且溴化乙锭又是极强的致癌物质。
所以目前最流行的分离纯化质粒DNA地方法是碱变性法。
2.碱变性法原理：是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当通过致冷或恢复中性pH值，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能准确复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
四、质粒载体的构建及其类型质粒载体必须具备的条件a.具有复制起点：这是质粒增殖所必不可少的条件，亦可帮助维持正常的质粒拷贝数b.具有抗菌素抗性基因：提供转化子的选择记号，理想的质粒载体应具两个抗菌素抗性基因。
在外源DNA插入之后，仍应保留一个强选择记号。
c.具有若干种限制酶单一识别位点：这一特点可满足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA 片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。
d.具有较小的分子量和较高的拷贝数：易于操作，而且在插入了外源DNA(一般不超过15Kb)仍可有效地转化受体细胞。
天然质粒用作克隆载体的局限性：（图）1.质粒载体选择记号在基因克隆中采用的质粒载体，大多数都是使用抗菌素抗性记号，一方面是由于许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子，另一方面因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。
下面是克隆中常用的几种抗菌素：a.氨苄青霉素抗性基因(ampr)b.氯霉素抗性基因(cmlr)c.卡那霉素抗生基因(Kanr)d.链霉素抗性基因(strr)e.四环素抗性基因(tetr)2.不同类型的质粒载体（图）五、重要的大肠杆菌质粒载体1．pSC101质粒载体是一种典型的严紧型控制的低拷贝的大肠杆菌质粒载体，是第一个成功地用于在E.coli中克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体：拷贝数：1-2个/cell分子大小：9.09Kb抗性表型：ter r2. pBR322质粒载体（图）①pBR322质粒载体的构建pBR322质粒按照标准的质粒载体命名法则命名的.”P”表示它是一种质粒;而”BR”分别取自该质粒的两位主要构建者F.BolivarR.L.Rodriguez姓氏的头一个字母.”322”实验编号,和其他质粒载体pBR325、pBR327相区别。