第二章分子克隆载体与宿主
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《分子克隆载体》PPT课件 (2)
基因)lacz’基因。
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但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
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构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
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15
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
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9
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
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10
以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
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3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)：
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
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分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
第二章 分子克隆载体与宿主
第一阶段（1977年前）：天然质粒和 重组质粒的利用 如pSC101, ColE1, pCR, pBR313 第二阶段：增大载体容量，建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因 第三阶段：进一步完善载体的功能以 满足基因工程克隆中的不同要求
4.载体的特点
至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物 体中有效复制，稳定遗传 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞 至少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA 插入 具有较小的分子量和较高的拷贝数 具有对受体细胞的可转移性, 提高载体导入受 体细胞的效率
pBR322质粒载体的优点:
◇具有较小的分子量
(经验表明,为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂,克 隆载体的分子大小最好不要超过10kb)
◇具有两种抗生素的遗传标记基因, 易于选择 重组DNA分子 ◇具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后， 每个细胞中可累积1000～3000个拷贝
pUC系列载体
4) 选择标记的插入失活
F plasmid
5） 不相容性
相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不
能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质
粒的不相容性。
a) 两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的
起始频率随机.
b) 分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分
裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。
抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖 体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制 核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合 成，细胞停止生长。 四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋 白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。
植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
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Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
第2章 基因克隆的载体——质粒和噬菌体
第2章基因克隆的载体——质粒和噬菌体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
一、载体的功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件二、载体应具备的条件：1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记附图：图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式2.1 质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。
分子量在1-200kb之间。
一、质粒的基本特性：（一）自主复制性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。
（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
（三）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。
pMB1或ColEI 类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。
生物技术 第二章 载体(2学时)
溶源性生:噬长菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色 体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被 裂解 。
λ噬菌体两种生长途径（示意图）
▪ 中央片段，12kb～24kb，含PL控制red 和gam基因。
非必需区
λ噬菌体克隆载体的构建策略
* 切去部分或全部非必需区，保留该酶的1个或2个识别位点作为克 隆位点，并且用点突变或甲基化酶处理方法使必需区内的该酶的识 别序列失效，避免外源DNA片段的插入； * 可在非必需区组入选择标记基因； * 36.4kb—51.5kb
一般特征
• 质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA 分子。
• 广泛存在于细菌中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中 也存在质粒。
• 它是一种裸露的比病毒更简单，有自主复制能力的D NA分子。
质粒种类很多，但作为克隆载体须具备:
⑴ 分子量相对较小，在细菌中稳定存在，拷贝指数高(松驰型质 粒拷贝数较多 )。
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）： 指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA），又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
装载容量：较大片断DNA，从6-8kb、10-20kb、30-45kb不等
λ噬菌体两种生长途径（示意图）
▪ 中央片段，12kb～24kb，含PL控制red 和gam基因。
非必需区
λ噬菌体克隆载体的构建策略
* 切去部分或全部非必需区，保留该酶的1个或2个识别位点作为克 隆位点，并且用点突变或甲基化酶处理方法使必需区内的该酶的识 别序列失效，避免外源DNA片段的插入； * 可在非必需区组入选择标记基因； * 36.4kb—51.5kb
一般特征
• 质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA 分子。
• 广泛存在于细菌中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中 也存在质粒。
• 它是一种裸露的比病毒更简单，有自主复制能力的D NA分子。
质粒种类很多，但作为克隆载体须具备:
⑴ 分子量相对较小，在细菌中稳定存在，拷贝指数高(松驰型质 粒拷贝数较多 )。
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）： 指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA），又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
装载容量：较大片断DNA，从6-8kb、10-20kb、30-45kb不等
基因工程：第二章 分子克隆(总)(1)
如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？
抑制蛋白质 Cop
起始因子 Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒： 1 - 3 拷贝，如pSC101 松弛型复制控制的质粒： 10 - 60 拷贝，如 ColE1 氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素 抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。
3、载体类型
2）按传代特性分：
自主复制型载体 含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。 穿梭载体 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆 整合型载体 不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主 基因组。
3、载体类型 3）按来源分：
质粒（Plasmid) 噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus) 考斯质粒（cosmid） 噬菌粒（phagemid） 人工染色体（YAC，BAC）
3、载体类型 1）按功能分：
克隆载体（cloning vector）
主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因 vector)
除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启 动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目 的基因。
2、质粒的不相容性
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 ，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成 不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
即cccDNA（covalently closed circular DNA) *质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
抑制蛋白质 Cop
起始因子 Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒： 1 - 3 拷贝，如pSC101 松弛型复制控制的质粒： 10 - 60 拷贝，如 ColE1 氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素 抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。
3、载体类型
2）按传代特性分：
自主复制型载体 含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。 穿梭载体 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆 整合型载体 不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主 基因组。
3、载体类型 3）按来源分：
质粒（Plasmid) 噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus) 考斯质粒（cosmid） 噬菌粒（phagemid） 人工染色体（YAC，BAC）
3、载体类型 1）按功能分：
克隆载体（cloning vector）
主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因 vector)
除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启 动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目 的基因。
2、质粒的不相容性
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 ，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成 不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
即cccDNA（covalently closed circular DNA) *质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
3载体与宿主系统
第二节 表达载体 第三节 宿主系统
载体的概念
在基因工程中，把能够携带外源基因 （或DNA片段），进入细胞复制、整合或 表达的DNA分子就称为载体（Vector）。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
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2016/12/10
理想基因工程载体必须具备的条件
2.质粒的提取和纯化的方法
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的方法：碱裂解法和试剂盒法，其中 碱裂解法是质粒提取最经典最常用的方法。
1）碱裂解法提取质粒的原理
强碱可以使质粒DNA和染色体DNA变性，但 由于二者拓补结构不同，虽然质粒DNA在强碱条 件下碱基配对也完全破坏但闭合环状质粒DNA不 像染色体DNA那样两条链彼此分离。因此，当加 入酸性的KAc后，质粒DNA可以复性溶解，而染 色体DNA不能复性沉淀下来。离心后，质粒存在 于上清液中。
载体的分类
按照功能分类：
克隆载体：一种能够携带外源基因或DNA片段进入宿主 细胞，并使其大量扩增的复制单元。 表达载体：能够携带外源DNA片段进入宿主细胞进行复制、 转录和翻译的载体。
第一节 克隆载体
按载体的来源：
质粒载体，噬菌体载体，粘粒载体，人工染色 体载体等
一．质粒载体 二．噬菌体载体 三．人工染色体载体
2） 碱裂解法所用的试剂
溶液Ⅰ 溶液Ⅱ 溶液 Ⅲ 溶液Ⅰ: 缓冲液和EDTA 溶液II: 高pH值的强阴离子洗涤剂会使细胞壁破裂，DNA和 蛋白质变性。 溶液III:低pH值乙酸钾起中和作用，使共价闭合质粒DNA复 性，而染色体DNA因分子量较大仍聚集成不可溶的 网状复合物沉淀。 50 mM Glucose; 25 mM Tris-HCl （pH 8.0）; 10 mM EDTA（pH 8.0 ） 0.2 M NaOH； 1% SDS 3 M KAc （pH 4.8）
分子克隆载体的选择-PPT课件
5. 合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点
第九节
分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点， 标记基因，载体容量等。
1. 克隆位点的建立
1) 体外重组
i. 减少限制酶识别位点 ii. 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头
2) 体内重组或突变
i. 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系 列载体时，去除Kanr 基因中的indIII位点就采用了以下技 术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切，
2. 标记基因的建立
1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子
3. 载体容量
尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题
1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位 点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落， 兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳 检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质 粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白 色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可 设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化 E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类， 即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样， 从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收 插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却
原核生物分子克隆的宿主和载体系统
5
二、乳糖操纵子
利用β-半乳糖苷酶及其基因 β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal
形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中 β-半乳糖苷酶的活性。
6
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白
诱导剂 IPTG
β-半乳糖苷酶-
α-肽段
分解半乳糖
➢ 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA 的合成 。
17
问题：在寄主复制后，质粒是如何分 配到子细胞中？
Par原件会附着在细胞膜上，随着细 胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中， 维持相对稳定的质粒拷贝数。
18
第二节 质粒载体
四、相ห้องสมุดไป่ตู้性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关 系密切的不同质粒，不能够在同一寄主 细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒 的不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒 称为不亲和质粒
3
二、乳糖操纵子
A) lac operon结构以及表达特性
lac Z: β -gallactosidase (β-半乳 lac I: 乳糖阻遏蛋白基因
糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）Plac :乳糖代谢结构基因的启动子
lac Y: lactose permease（半乳糖苷
透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)
30
31
32
二、基于λ噬菌体的克隆载体
1、对野生λ噬菌体的改进
A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的 RNA探针的载体 E、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶 形成融合蛋白的载体。
二、乳糖操纵子
利用β-半乳糖苷酶及其基因 β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal
形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中 β-半乳糖苷酶的活性。
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β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白
诱导剂 IPTG
β-半乳糖苷酶-
α-肽段
分解半乳糖
➢ 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA 的合成 。
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问题：在寄主复制后，质粒是如何分 配到子细胞中？
Par原件会附着在细胞膜上，随着细 胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中， 维持相对稳定的质粒拷贝数。
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第二节 质粒载体
四、相ห้องสมุดไป่ตู้性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关 系密切的不同质粒，不能够在同一寄主 细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒 的不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒 称为不亲和质粒
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二、乳糖操纵子
A) lac operon结构以及表达特性
lac Z: β -gallactosidase (β-半乳 lac I: 乳糖阻遏蛋白基因
糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）Plac :乳糖代谢结构基因的启动子
lac Y: lactose permease（半乳糖苷
透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)
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二、基于λ噬菌体的克隆载体
1、对野生λ噬菌体的改进
A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的 RNA探针的载体 E、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶 形成融合蛋白的载体。
华中农业大学生物化学考研试题库附答案 基因工程基础
第18章基因工程基础一、教学大纲基本要求用工具酶、克隆载体与表达系统；基因克隆的一般原理与过程，目的基因的分离，目的基因的克隆；克隆基因的表达；因表达的控制元件，外源基因在原核系统中的表达；外源基因在真核系统中的表达。
二、本章知识要点（一）基因工程概念基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。
基因工程的核心技术是DNA重组。
蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的，它是指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。
基因工程开辟了生物学研究的新纪元。
借助基因工程，分子生物学的发展达到空前的速度和规模，新的研究领域不断被开拓。
“人类基因组计划”是生物学历史上最巨大的科学工程；后基因组的时代已经到来。
基因工程带动了生物技术产业的兴起。
制药、化工、食品、农业和医疗保健业无不得益于基因工程。
基因工程帮助人类认识和改造生命世界，也帮助人类认识自己。
设计和创建新的基因、新的蛋白质和生物新的性状的时代。
（二）分子克隆的基本原理克隆(clone)意为无性繁殖系。
DNA克隆即将DNA的限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子。
故DNA克隆为分子克隆。
1、ＤＮＡ限制酶与连接酶DNA分子克隆，即将DNA的限制片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，获得相同的DNA 扩增分子。
切割DNA分子需要用限制性核酸内切酶。
生物来源不同但识别序列与切割序列相同的限制酶，称为同裂酶(isoschizomers)；切割产生单链末端相同的限制酶，称为同尾酶(isocaudamers)。
相容（compatible ende）的限制片段可用DNA连接酶(DNA ligase)相连接。
平末端连接效率较低，利用接头(linker)、衔接物（adaptor）或在平末端加上互补均聚物可以帮助平末端连接。
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
第二章--载体
非必需片段
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
2010
CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ COS序列
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
• 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点， 不利于重组操作，必须删除至1 - 2个
• 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增 加一些单一的酶切位点。如利用酶切和采用定点突变技术
Ptac
TTGACA
TATAAT
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
PlacZ启动子的可控性
阻遏蛋白 基底水平转录
P
乳糖 异丙基-b-D-硫代
半乳糖苷（IPTG）
O
诱导
高效转录
P
2010
O
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
PlacZ启动子的可控性
cAMP CAP 高效转录
Plac
葡萄糖代谢
O
cAMP浓度降低 基底水平转录
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
1、质粒的基本特征
（1）质粒的自主复制性：
ColE1、pMB1、 pSC101等不同启动子 pMB1质粒DNA复制启动控制模型
目前公认的用于阐释质粒 DNA复制控制机理的分子模 型有两种：其一是抑制蛋白质 稀释模型（inhibitor dilution model）。后者的关键论点 是，阻遏蛋白质是组成型合 成，其浓度同质粒的拷贝数成 正比。其二是自体阻遏蛋白质 模型（autorepressor model）,核心内容是，阻遏蛋 白质的合成受负反馈 （negative feedback）机理 调节，而且其浓度是恒定的。
分子生物学2009-6
中去除5′→3′ 切酶活性的Klenow片段。该酶常用于测序、
探针标记等。
Taq DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶使是一种耐热的依赖
于DNA的DNA聚合酶。最佳作用温度为72℃ ～80℃。常用 于PCR反应和测序反应。
逆转录酶： 反转录酶是以RNA为模板的DNA聚合酶。常
用于合成互补DNA（cDNA）。
分子生物学
杨孝朴
第七章
1 基因工程工具酶
基因工程
2 分子克隆载体与宿主细胞 3 DNA建立 4 目的基因的获得5 目的基因与载体的连接
6 重组DNA分子导入受体细胞 7 重组体的筛选
8 克隆基因的表达
第七章
基因工程
基因工程兴起于20世纪70年代初。1972年Berg P和他的同事将 首次构建出DNA的重组体。由于SV40能使动物致癌，出于安 全的 考 虑 ， 这 项 工作没有进行下去 。 第二年 ，Cohen S和 得到基因的分子克隆，由此产生了基因工程。
衔接头可以使DNA片段的平末端转变为黏性末端，或由一种
黏性末端转变为另一种黏性末端，并且无需用限制酶切，在
基因工程中十分有用。
例如：EcoRⅠ-SmaⅠ平末端衔接头 5′-AATT CCCGGG-3′ 3′-GGGCCC-5′ EcoRⅠ-XmnⅠ-BamHⅠ衔接头 5′-AATT CGAACCCCTTCG-3′
DNA聚合酶（常用DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow酶）填补缺
口，最后由T4DNA连接酶连接（见图）。
另外的一种连接方式是粘平末端的连接，即要连接的DNA片 段的一端为粘端、另一端为平端。产生“粘-平”方式的末 端有两条途径，即用一个产生平性末端的限制性内切酶（如 Sma Ⅰ ， HpaⅠ ） 与 一 个 产 生 粘 性 末 端 （ 如 EcoR Ⅰ, BamHⅠ）的内切酶切割目的基因与载体；或先用一个产生 粘性末端的内切酶酶切DNA，然后用修饰酶补平或消平粘性
《分子克隆》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选第六节重组dna分子的操作过程118限制性内切酶dna连接酶基因载体目的基因染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达119农业应用获得高产稳产和具有优良品质的农作物向日葵培育具有抗逆性的作物新品种抗虫抗病毒抗除草剂抗盐碱抗高温抗干旱第七节基因工程的应用培育体形巨大品质优良的动物超级小鼠超级绵羊超利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达获得人们需要的物质激素抗体酶食品工业开辟新是食品来源鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中畜牧养殖业120世界上第一只转基因动物能产药的奶牛转基因羊转基因鱼上面121本章结束本章结束此课件下载可自行编辑修改供参考
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7
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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8
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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35
第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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7
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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8
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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35
第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
生物化学课件 第二章 重组DNA技术
43
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
特点 以mRNA作为模板,以dNTP为底物， RNA指导 的DNA聚合酶 (RDDP，RNA-dependent DNA polymerase ) 种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV） Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV) 用途： （1）逆转录合成cDNA （2）补平或标记5’粘端 （3）DNA测序 （4）制备探针
库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。
37
（三）DNase I
1. 特点：
内切酶，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特 异型（随机切割），产生5’-磷酸脱氧寡核苷酸。
2. 用途：
1) 切口平移法，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
38
重组DNA技术中常用的工具酶
29
3、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase )
特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。 具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺 乏3’ 5’ 外切酶活性，因而无校正阅读功能。
用途：（1）PCR
（2）DNA序列测定
30
4、逆转录酶(Reverse Transcriptase ,RTase)
33
T4多核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase)
催化将 ATP 的 γ- 磷酸转移到DNA链的 5’ -末端。 用途： （1）放射性标记DNA链的5’ -末端，用于DNA 测序或探针制备。 （2）将人工接头和其它没有 5’ -末端磷酸的
2-2章 大肠杆菌分子克隆载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
30℃下培养：
阻遏 蛋白
ori
PL
目的基因
42℃下培养：
阻遏 蛋白
失活
目的基因
λPL和 λPR
λPL和PR 是λ噬菌体上2个主要的启动子，都是 启动能力相当强的转录构件。把λ启动子连同其附 属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以λ启动 子为组件的质粒。
三、λ -DNA载体的构建
λ噬菌体的缺陷：
质粒DNA的转移和复制
5' 3' 3'5'
2）质粒转移的必备条件 ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺 式 作用（cis-action） ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用 ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用 3）质粒转移类型 ⅰ.自我转移（Self-transmissible） ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若 无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可 提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只 有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具 备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上， 该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种 细胞的频率。
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pBR322质粒载体的优点:
◇具有较小的分子量
(经验表明,为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂,克 隆载体的分子大小最好不要超过10kb)
◇具有两种抗生素的遗传标记基因, 易于选择 重组DNA分子 ◇具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后， 每个细胞中可累积1000～3000个拷贝
pUC系列载体
Life cycle:
◇ lytic cycle(裂解周期） ◇ lysogenic cycle（溶源周期）
1. λ噬菌体的基本特点
3）. 噬菌斑 A. λ 噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基，
37C° 过夜。 B. 固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是
装成β4才具有酶活性——α-互补作用 ◇ 为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)
β—半乳糖苷酶基因的优点
◇酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观
5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactoside
◇LacZα和β链基因的分别表达可使载体小 而容量的大
c) 来自T7 噬菌体的T7 启动子。必须由T7 噬菌 体来源 T7 RNA聚合酶识别起始转录。
d) 表达载体用T7 启动子必须用能产生T7 RNA 聚 合酶的受体菌株 JM109 , DE3。
问题：
4.关于穿梭质粒载体，下面哪种说法最正确（） A. 在不同的宿主中具有不同的复制机制 B. 在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 C. 在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 D. 在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率
是在pBR322基础上衍生出来的一 系列质粒载体
pUC质粒载体的优点:
◇具有更小的分子量和更高的拷贝数 （2.7kb, 500~700 copies/cell）
◇适用于组织化学法检测重组体，一步 实现对阳性克隆的鉴定
◇具有多克隆位点区（MCS）
Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA
质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染 色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双 链DNA分子 (1~500 kb)
(Covalently closed circular DNA, cccDNA)
Plasmids: smaller cycles of doublestrand DNA that do not carry essential genes
4. 常用的质粒载体
pBR322
Ampr
Tc
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Ampr Tcr
转化
有DNA插入
Ampr Tcs 外源DNA
Ampr Tcr
Ampr Tcs
无菌落
筛选重组子
阳性菌落
A m p + Tc平 板
提取DNA 电泳
A m p平 板
重组DNA Ampr Tcs
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
氯霉素抗性基因（Cmr）
抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖体 50 S亚基上，阻止蛋白质合成。
Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使 氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不 能结合在核糖体上。
卡那霉素(Kanr)、 新霉素(Neor)、G418 抗性基因(G418r)
杀 菌 剂 ， Kanamycin ， Neomycin 和 G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗 生素，可结合在核糖体上，导致mRNA 发生错读。
标记基因的作用：
指示外源DNA分子（载体或重组分子） 是否进入宿主细胞
指示外源DNA分子是否插入载体分子形 成了重组子
标记基因的种类： 抗性标记基因 营养标记基因 生化标记基因
常用的遗传标记基因
四环素抗性基因（Tcr）
抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖 体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制 核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合 成，细胞停止生长。
质 粒 载 体 克 隆 的 一 般 步 骤
see movie
3．质粒的分类及用途
1）克隆质粒： 用于克隆和扩增外源基因。 2） 测序质粒： a) 高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。 b) 含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近
区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性 后即可测序。
b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载 体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复 制并遗传。
5）探针质粒 a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，
终止子。 b) 装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗
性基因） c) 缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因 d) 当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，
报告基因才能表达。 e) 表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件
的强弱。
6）表达质粒 a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转
录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点 （SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位 点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表 达。
b) 大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp 和来自 噬菌体强启动子 PL, PR 。它们由大肠杆菌 RNA 聚合酶识别起始.
第一阶段（1977年前）：天然质粒和 重组质粒的利用 如pSC101, ColE1, pCR, pBR313
第二阶段：增大载体容量，建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因
第三阶段：进一步完善载体的功能以 满足基因工程克隆中的不同要求
4.载体的特点
至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物 体中有效复制，稳定遗传
2.质粒的改造、构建与使用
删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA的 装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细 胞)
加入遗传标记基因 在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点的
DNA序列，即多克隆位点(multiple cloning sites， MCS) 根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列 灭活某些质粒的编码基因
二 . λ载体（ Lambda vector ）
主要内容：
1. λ噬菌体的基本特点 2. λDNA作载体的优缺点和解决办法 3. λ载体
1. λ噬菌体的基本特点
1）. 是大肠杆菌温和型噬菌体 2）.大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒，
噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，λ- 噬 菌体悬浮液加到大肠杆菌液体培养基，37C°培养6小时，培养 液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。
第二章 分子克隆载体与宿主
Vecotrs and Host Cells
主要内容
第一节 分子克隆载体的特点 第二节 大肠杆菌克隆载体 第三节 真核细胞的克隆载体 第四节 宿主系统
第一节 分子克隆载体的特点
1.载体的定义 2.分子克隆载体的功能 3.发展概况 4.载体的特点 5.遗传标记基因
1). 具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和 控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立 复制子 (Replico) 结构。
2）可扩增性。 ▲严紧型复制质粒 (Stringent) 每个细胞复制1-5 个质粒拷贝。 ▲松弛型复制质粒 ( Relaxed) 具有高拷贝数30-50个。
cZ基因通常用于构建质粒载体的目的是什么？（） A. 编码一种限制性内切核酸酶，在转化细胞时用于切
割载体
B. 编码蓝色色素产物，可用于示踪转化的细胞 C.编码一种酶，将RNA转化为DNA D.编码一种抗生素抗性的酶 E.编码一种可检测的酶，当基因内部的位点插入任何外
1.分子克隆载体的定义
分子克隆载体(vector)是一类可供外 源DNA插入并携带重组DNA分子进 入适当宿主细胞的DNA分子
2.分子克隆载体的功能:
为外源基因提供进入受体细胞的转移 能力
为外源基因提供在受体细胞的复制或 整合能力
为外源基因提供在受体细胞中的扩增 和表达能力
3.发展概况
来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基 因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能 进入细胞内。
Байду номын сангаас
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
◇ β—半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 ◇ 其氨基末端称为α链，羧基末端称为β链 ◇ α链负责将β链装配为四聚体 ◇ 单独的β链不具酶活性，只有在α链的帮助下组
源片段，ORF遭到破坏时，产物即不能表达。
第二节 大肠杆菌克隆载体
主要内容
一. 质粒载体 二. λ载体 三. cos 质粒 四. 细菌人工染色体
质粒载体
1.质粒的基本特性 2.质粒的改造、构建与使用 3.质粒的分类及用途 4.常用的质粒载体
1. 质粒的基本特性
四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋 白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。
氨苄青霉素抗性基因（Apr）
杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞 膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰 细胞分裂，杀死细胞。
Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细 胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解， 使氨苄青霉素失活。
至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞
至少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA 插入
具有较小的分子量和较高的拷贝数
具有对受体细胞的可转移性, 提高载体导入受 体细胞的效率
5.遗传标记基因
标记基因的作用 标记基因的种类 常用的标记基因
绿色荧光蛋白基因（GFP）