分子克隆之载体构建完整步骤
载体构建实验方法及步骤
载体构建实验方法及步骤载体构建（vectorconstruction）是分子生物学研究常用的手段之一。
依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
实验步骤1.载体选择：根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
以Nrf2基因序列：1794bp 为例；2.引物设计：引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接。
Nrf2pC1EcoR-F：CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGT TGCCACCNrf2pC1BamH-R：CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCT TCTTGC3.PCR扩增：以小鼠光感受器细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点，1%琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带（1794bp）。
4.载体和目标片段的限制性酶切：质粒载体Plvx-DsRed-monomer-C1和目的基因PCR产物的Ec oRI和BamHI双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2h；1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx-DsRed-monomer-C1酶切大片段和目的基因酶切片段。
5.连接转化：质粒Plvx-DsRed-monomer-C1 EcoRI+BamHI酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应12小时。
取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基，37℃恒温摇床培养50min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100ug /ml Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
6.挑取克隆提质粒验证：挑取5个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB 培养液中，300rpm，37℃恒温摇床培养过夜，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行测序验证。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
克隆载体表达载体构建详细版
一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
构建克隆载体步骤
构建克隆载体步骤构建克隆载体主要有以下步骤：一、基本动作要领1. 目的基因的获取- 首先，如果是从基因组DNA中获取目的基因，咱们就得先提取基因组DNA。
就像摘果子得先找到果树一样，这里提取基因组DNA的方法有很多，像酚- 氯仿抽提法就比较经典。
提取的时候，一定要保证样本的新鲜度。
我之前就做错过，用了放置很久的样本，结果提取出来的DNA 质量特别差。
如果是从mRNA经反转录得到cDNA再获取目的基因的话，就要注意mRNA的质量了。
要使用质量好的逆转录酶，这就好比建房子得用好的砖头，mRNA就是建基因这座“房子”的砖头。
2. 载体的选择- 载体就像是一辆“车”，用来搭载我们的目的基因。
常见的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
如果是简单的在细菌里克隆，一般就选质粒载体。
要根据自己的实验需求来选，比如要有合适的筛选标记，像抗药性基因之类的，这样才能方便后续筛选出带有重组载体的细胞。
3. 目的基因和载体的酶切- 这是很关键的一步，要选择合适的限制性内切酶。
就像开锁得用对钥匙一样，酶切位点必须是载体和目的基因上都有的，而且要在合适的反应体系里进行。
酶切反应的缓冲液、温度、反应时间都得严格控制。
我试过好多次，温度稍微不对，酶切就不完全。
反应体系里的底物浓度也要合适，别加太多或者太少的DNA，就像做菜加盐一样，得适量。
- 给大家简单画个示意图来理解一下。
就好比长条形的目的基因和环状的载体，用内切酶在特定的位置“咔嚓”一刀，这样就产生了可以连接的黏性末端或者平末端。
二、个人小技巧1. 在酶切之前，可以先做个小的预实验。
就像试水温一样，看看用什么浓度的酶、多长的反应时间是最合适的。
对了这里可以把目的基因和载体分别做预酶切，这样如果有问题就可以很快定位是哪一个的问题。
2. 在选择内切酶的时候，尽量选择产生不同黏性末端的酶，这样在连接的时候特异性会更好。
这就好比把两个不同形状的拼图碎片拼在一起，不容易拼错。
三、容易忽视的细节1. 酶切完后一定要进行凝胶电泳来检验酶切产物是否正确。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆详细步骤
分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。
在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。
然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。
接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。
2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。
首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。
然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。
PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。
3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。
连接后的载体含有目标DNA的序列。
4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。
这一步骤通常称为转化。
转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。
宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。
5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。
抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。
报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。
限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。
以上就是分子克隆的详细步骤。
通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。
分子克隆详细步骤
分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)3、移至1.5mlEP管，静置5分钟4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4度7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃,overnight.2、Then,100℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.Lysis buffer:(store at 4℃)KCl 0.5MTris 0.1MNP-40 1%Tween-20 1%二、RT-PCR：1、预变性体系12ul：Total RNA 2ulOligo（dT18）primer 1ulDH water 9ul65℃ 5min 速置冰上2、RT体系：20ul：预变性体系12ul5×buffer 4ulRNAase inhibiter 1ul10m dNTP 2ulMMLV 1ul42℃ 60min70℃ 5min12℃ forever3、PCR体系20ul：10×buffer 2ul10m dNTP 0.5ulPrimer(F+R) 1ul （0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ulPfu 0.2uldd water 15.3ul95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑胶鉴定PCR产物：四、醇沉PCR产物：1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀3、—80℃静置30min4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干6、加入25-20ul dd water 吹匀静置10-20min待溶解五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme1 1ulEnzyme2 1ul10×Buffer 5ul （在体系中被稀释成1×）10×BSA 5ul （看需要）Template 1ugADD dd water to 50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）PCR酶切产物纯化：1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳2. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录1.分子克隆技术的概念与原理2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用领域4.分子克隆技术的优势与局限性正文一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是一种在生物体外将特定 DNA 片段复制并插入到载体DNA 中的技术。
这种技术可以使得新的 DNA 分子与载体 DNA 相结合，形成一个具有自我复制能力的 DNA 分子。
在实际应用中，分子克隆技术主要通过将目的基因与载体 DNA 连接，从而实现对目的基因的扩增和表达。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：从待研究的生物体中提取需要克隆的 DNA 片段，通常使用 PCR 技术进行扩增。
2.构建载体：选择合适的载体 DNA，将其与目的基因连接，构建成一个完整的克隆载体。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体转化到受体细胞中，让受体细胞表达出目的基因。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从转化后的细胞中筛选出含有目的基因的克隆子。
5.鉴定克隆子：对筛选出的克隆子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、分子克隆技术的应用领域分子克隆技术在生物学研究中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 连接，实现对目的基因的扩增和表达。
2.蛋白质工程：通过分子克隆技术，可以研究蛋白质的结构和功能，为药物研发提供重要依据。
3.基因组学：通过分子克隆技术，可以对基因组 DNA 进行拼接和分析，揭示生物体的基因组结构。
4.转基因技术：通过分子克隆技术，可以将目的基因插入到载体 DNA 中，实现对转基因生物的研究和开发。
四、分子克隆技术的优势与局限性分子克隆技术在生物学研究中具有明显的优势，如操作简单、扩增效率高、可控性强等。
然而，分子克隆技术也存在一定的局限性，如克隆效率受载体 DNA 大小限制、克隆过程中可能出现突变等。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是指利用体外的人工方法将一个DNA分子（称为目的DNA）复制到一组DNA分子（称为载体DNA）中的过程。
这项技术能够在体外精确复制和扩增DNA分子，从而可以用于研究基因功能、制备重组蛋白、基因治疗等领域。
下面是分子克隆技术的详细步骤：1.选择载体DNA：首先需要选择一个合适的载体DNA，一般会使用细菌的质粒作为载体，因为细菌质粒具有稳定、易扩增和实验操作简单的特点。
2.制备DNA片段：将目的DNA通过PCR扩增或者其他方法制备出来。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶在体外将目的DNA的特定序列进行大规模复制的过程，一般需要利用引物引导PCR反应。
3.处理载体DNA：将载体DNA进行处理，一般需要进行酶切。
通过选择性酶切酶将载体DNA的一部分切除，形成切口，为接下来的目的DNA连接提供空位。
4.连接DNA：将目的DNA与处理后的载体DNA连接起来。
一般利用DNA连接酶进行连接，将目的DNA的末端与载体DNA的末端互补连接。
连接反应通常需要一定时间和温度来保证连接的效率和稳定性。
5.转化细胞：将连接好的DNA转化到细菌等宿主细胞中。
这一步可以通过热激转化、电转化等方法实现。
转化后，将细胞培养在含有相应抗生素的培养基上，只有携带目的DNA的细菌才能存活，从而筛选出含有目的DNA的克隆。
6.筛选克隆：通过筛选抗生素抗性或其他标记物的方法来筛选出含有目的DNA的细菌克隆。
一般需要进行筛选接种、PCR鉴定、酶切及测序等手段来确认克隆是否含有目的DNA，并进一步分析目的DNA的表达和功能。
这些步骤是分子克隆技术的基本流程，但在实际操作中可能会根据具体情况进行相应的调整和优化。
分子克隆技术的发展和应用使得我们可以对基因进行精确操作和研究，对于推动生命科学的发展和应用具有重要的意义。
分子克隆以及蛋白纯化流程
分子克隆以及蛋白纯化流程分子克隆是利用重组DNA技术将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
它是现代生物技术中最常用的技术之一，被广泛用于基因工程、基因治疗、药物研发等领域。
蛋白纯化则是从复杂的混合物中分离和纯化目标蛋白质的过程，用于蛋白质的进一步研究和应用。
分子克隆的步骤通常包括：1.获取目标基因：从目标生物体中提取DNA，或通过合成DNA片段获得目标基因。
2.DNA片段的处理：将目标基因与载体DNA进行酶切，利用酶切酶切割酶将片段粘贴到载体DNA上。
3.载体构建：将连接好的基因载体转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌等。
4.选择与鉴定：利用抗生素等筛选方法，筛选带有目标基因的转化细胞，并通过PCR、酶切等方法验证克隆是否成功。
5.大规模培养：将带有目标基因的细胞进行大规模培养，以获取足够数量的重组蛋白质。
蛋白纯化的一般流程如下：1.细胞裂解：使用各种方法如超声波、高压等将菌体或细胞破裂，释放目标蛋白质。
2.清除杂质：通过离心等方法去除琼脂、酶、核酸等杂质。
3.选择性分离：利用特异性亲和剂、柱层析、电泳等方法将目标蛋白质分离出来。
4.蛋白质的浓缩和纯化：通过滤膜、浓缩柱、洗脱缓冲等方法将目标蛋白质浓缩并进一步纯化。
5.成品蛋白质的储存和保存：将纯化得到的目标蛋白质进行储存，以备后续研究和应用。
需要注意的是，以上仅为分子克隆和蛋白纯化的一般流程，具体的步骤可能会因实验设计、目标蛋白质的性质和要求等而有所不同。
此外，实验过程中还需要配制相应的缓冲液、培养基和试剂，操作注意安全和操作规范。
分子克隆和蛋白纯化是复杂而精细的实验技术，需要仔细操作和合理设计实验方案，以确保实验的成功和结果的准确性。
分子克隆技术的操作流程
分子克隆技术的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介二、分子克隆实验材料与设备三、分子克隆实验步骤1.设计引物2.合成目的基因3.构建表达载体4.转化受体细胞5.筛选转化子6.鉴定目的基因四、分子克隆实验注意事项五、实验结果分析与应用正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，通过复制特定DNA序列，将目的基因在受体细胞中稳定表达。
该技术在基因工程、生物科学等领域具有广泛应用，有助于研究基因功能、蛋白质表达及药物筛选等。
二、分子克隆实验材料与设备1.实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。
2.实验设备：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、分子克隆实验步骤1.设计引物根据目的基因序列，设计一对互补的引物。
引物应具备一定的特异性，避免非特异性扩增。
2.合成目的基因利用PCR技术，以DNA模板为基础，通过引物扩增目的基因。
反应条件需根据所使用DNA聚合酶的要求进行优化。
3.构建表达载体将目的基因与载体DNA连接，形成表达载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4.转化受体细胞将构建好的表达载体转化到受体细胞中，如大肠杆菌、酵母等。
转化方法有化学法、电转化法等。
5.筛选转化子转化后的受体细胞在含相应抗生素的培养基上生长，筛选出含有目的基因的转化子。
6.鉴定目的基因对筛选出的转化子进行进一步鉴定，如DNA测序、基因表达分析等。
四、分子克隆实验注意事项1.实验过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.选择合适的引物长度和退火温度，以提高扩增特异性。
3.转化受体细胞时，注意操作力度，避免细胞损伤。
4.筛选转化子时，严格控制抗生素浓度，避免过度筛选。
五、实验结果分析与应用1.分析PCR产物，判断目的基因是否成功克隆。
2.鉴定目的基因的表达水平，评估实验效果。
3.将成功克隆的目的基因应用于基因敲除、基因表达等研究。
通过以上步骤，您可以顺利完成分子克隆实验。
实验过程中需严格操作，确保实验结果的准确性。
分子克隆技术构建流程
分子克隆技术构建流程一、目的基因的获取。
咱得先把要克隆的那个基因搞到手呀。
这就好比是要找一个特别的小宝贝。
有时候这个基因是从生物体的基因组里来的，那就得像个探险家一样，在那巨大的基因库里面去挖掘它。
可以用一些方法，像是从细胞里提取出DNA，然后再用各种酶去把我们想要的那段基因切下来。
还有的时候呢，这个基因是人工合成的，就像是自己动手捏一个小玩偶一样，按照我们知道的基因序列，一点点把它拼出来。
二、载体的选择。
接下来就该给我们的目的基因找个“小房子”啦，这个“小房子”就是载体。
载体的种类可不少呢。
就像住房子有不同的户型一样，有质粒载体，这是比较常用的一种，它就像个小公寓，结构简单又好用。
还有噬菌体载体，感觉就像是个小飞船，能带着基因在细菌的世界里遨游。
选择载体的时候呀，得看看这个载体能不能装下我们的目的基因，就像挑房子得看空间够不够大一样。
而且还得看这个载体在宿主细胞里好不好生存，就像我们挑房子还得看周围环境适不适合居住。
三、目的基因与载体的连接。
四、重组DNA导入宿主细胞。
组合好的这个带有目的基因的载体，就得送进宿主细胞这个“大社区”里啦。
这就像送一个小包裹一样。
如果宿主细胞是细菌的话，就可以用转化的方法，就像给细菌开个小后门，让重组DNA偷偷溜进去。
要是宿主细胞是真核细胞呢，那就可能得用转染的方法啦，就像用个小快递员把包裹送进去。
这个过程可不能马虎，要是送不进去，前面的努力可就白费啦。
五、筛选阳性克隆。
进了宿主细胞之后呢，可不能乱套了。
我们得把那些成功接纳了重组DNA的细胞找出来，这就是筛选阳性克隆。
可以利用载体上带有的一些特殊标记，就像给那些正确的小包裹贴个小标签一样。
比如说有的载体带有抗生素抗性基因，那我们就可以在培养基里加上这种抗生素，那些没有接纳重组DNA的细胞就会死掉，只有接纳了的才能存活下来。
这样就像大浪淘沙一样，把我们想要的细胞给筛选出来啦。
分子克隆技术虽然听起来很复杂，但就像做一场有趣的游戏一样，每一步都有它的乐趣和挑战呢。
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分子克隆之载体构建完整步骤
一、目的片段的扩增和酶切
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
准备：
A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落
B.引物配制：
a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁
nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。
b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul
工作液。
终浓度200-400nM。
1. PCR反应体系(50ul)
Taq酶体系：Thermo
10x buffer （无Mg2+）5ul
MgCl2（25mM）5ul
dNTP （10mM）1ul
上下游引物工作液1ul
模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul
Taq DNA聚合酶0.5ul
ddH2O 补充至50 ul
注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。
2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。
PCR仪设置反应条件：
95℃ 5min 预变性
循环x30-35：
变性95℃ 30s
退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）
延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸
4-10℃ 保温
高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo
10x buffer 5ul
dNTP （10mM）1ul
上下游引物工作液1ul
模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul
pfu DNA聚合酶1ul
ddH2O 补充至50 ul
PCR仪设置反应条件：
95℃ 5min 预变性
循环x30：
变性95℃ 30s
退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）
延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）
72℃ 7 min 补充延伸
4℃ 保温
2. 琼脂糖凝胶电泳验证
取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。
（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+ 1%琼脂糖, 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入1/10000 Gelred染色液混匀倒板。
注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。
3. PCR产物纯化: （目前多数公司的PCR体系可兼容后续酶切反应，无需纯化）
根据PCR产物纯化试剂盒上流程回收PCR产物,最后用50 ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
4. 酶切（50ul体系）
PCR产物:
PCR纯化产物43ul
10xBuffer 5ul
E1 1ul
E2 1ul 酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应2+h（Thermo 的Fastdigest系列快切酶，37℃反应30min-1h）。
PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物, 最后用30-50ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+1ul DNA Loading buffer混匀上样，150V 恒压电泳20-30min，保存电泳图片，确保回收到目的片段。
PCR产物酶切的简化步骤：
（1）取2-5ul PCR产物电泳验证是否有目的条带，若有，其余PCR产物直接进行酶切后切胶回收；若条带单一也可酶切后采用PCR产物纯化试剂盒回收。
（2）直接将全部PCR产物电泳，目标片段切胶回收；回收的PCR产物直接酶切：17ul 产物+2ul 酶切10x buffer+0.5ul E1+0.5ul E2，37℃反应过夜或者37℃反应2+h （或Thermo快切酶1h），80℃ 5min灭活可直接用于连接。
（确保酶切体系兼容后续连接反应体系）
二．载体制备
1. 质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。
2. 载体酶切（50ul）
质粒DNA 2-5ug
10xBuffer 5ul
E1 1ul
E2 1ul
ddH2O 补足至50ul
反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜（或Thermo 快切酶2h）。
3. 琼脂糖凝胶电泳及胶回收：取5ul酶切载体+1ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时等量未酶切的质粒做对照，保存电泳图片（切开后的线性载体应该是单一条带，比未酶切的环状载体跑得慢，后者通常可见线性、环状、超螺旋三条带）；切胶回收酶切载体，最后用30-50ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
三、外源DNA片段插入质粒载体
1. 外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul体系）
DNA片段 6.5ul/7.0ul/7.5ul
载体2ul/1.5ul/1ul
T4 DNA Ligase（Thermo）0.5ul
Buf T4 DNA Ligase 1ul
反应条件：首选16℃过夜连接，其次22℃常温1h或者4℃连接24小时。
一般目的片段与载体摩尔比约为5-10:1，但是这里我们通常是按体积比。
一定要做阴性对照：及上述体系连接酶以相同体积ddH2O代替。
2. 连接产物转化
将全部连接产物加入不少于10倍体积的感受态细菌（100ul分装的DH5a或TOP10）中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴静置2min，加入500-800ul（一般500）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温预培，40min-1h（若质粒为氨苄抗性无需预培养，时间允许不推荐）。
8000 rmp离心45s，沉淀保留约100ul上清，吹打混匀后均匀涂布抗性平板上。
37℃恒温箱培养14h以上。
附质粒转化步骤：
取质粒1ul或50-100ng加入50-100ul感受态细菌中，后续同连接产物转化步骤，预培养后无需离心，取100ul菌液涂板即可，37℃恒温箱培养过夜。
注：
1、一定要区分质粒和连接产物转化的不同。
2、根据实验要求选择所需要的感受态，克隆扩增用DH5a或TOP10，蛋白表达用BL-21。
3、在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定。
四、克隆的筛选鉴定
（1）筛选鉴定- 酶切鉴定
1.挑取3-5个克隆接种到5ml LB培养基中，37℃恒温箱培养过夜。
按质粒小抽试剂盒步骤完成质粒提取，并测定DNA浓度。
2.酶切(20ul) 体系：
质粒DNA 0.5-1ug
Buffer 2ul
E1 0.5ul
E2 0.5ul
加ddH2O 至20ul
37度酶切2h，快切酶30min-1h。
琼脂糖凝胶电泳检测。
如果有目标条带，相应克隆的质粒送测序。
（2）筛选鉴定- 菌落PCR (20ul)
ddH2O 9.5ul
2x Taq buffer （Takara）10 ul
上下游引物工作液（10mM）0.5ul
模板为单菌落不算体积
配制方法：10个克隆，上述每种成分所需体积x10x1.125ul（1.125系数为防止枪头加样误差），混匀后，20ul分装PCR管备用。
挑菌落方法：挑菌落前准备相应抗性平板1-2块，画好方格，标记或编号，用10ul枪头挑选菌落后先在平板相应方格取中心点一下，再将枪头放入上述分装好的PCR管中吹打两下即可。
PCR反应条件（参考目标片段的PCR条件）：
95℃ 5min（95℃ 30s . 60℃ 30s . 72℃ 60s）x25 72℃ 5min. 4-10℃保温，电泳验证。
注：阳性率低时，每个项目需挑选5个以上单菌落做菌落PCR。
克隆验证：将电泳验证具有目标片段的克隆（对应平板的方格中），接种到5ml 含相应抗性的LB培养基，37℃ 200rmp培养过夜，小量提取质粒后送测序。