分子克隆之载体构建完整步骤

分子克隆之载体构建完整步骤

一、目的片段的扩增和酶切

PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。

准备：

A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落

B.引物配制：

a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁

nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。

b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul

工作液。终浓度200-400nM。

1. PCR反应体系(50ul)

Taq酶体系：Thermo

10x buffer （无Mg2+）5ul

MgCl2（25mM）5ul

dNTP （10mM）1ul

上下游引物工作液1ul

模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul

Taq DNA聚合酶0.5ul

ddH2O 补充至50 ul

注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。

PCR仪设置反应条件：

95℃ 5min 预变性

循环x30-35：

变性95℃ 30s

退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）

延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸

4-10℃ 保温

高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo

10x buffer 5ul

dNTP （10mM）1ul

上下游引物工作液1ul

模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul

pfu DNA聚合酶1ul

ddH2O 补充至50 ul

PCR仪设置反应条件：

95℃ 5min 预变性

循环x30：

变性95℃ 30s

退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）

延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）

72℃ 7 min 补充延伸

4℃ 保温

2. 琼脂糖凝胶电泳验证

取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+ 1%琼脂糖, 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入1/10000 Gelred染色液混匀倒板。

注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。

3. PCR产物纯化: （目前多数公司的PCR体系可兼容后续酶切反应，无需纯化）

根据PCR产物纯化试剂盒上流程回收PCR产物,最后用50 ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.

4. 酶切（50ul体系）

PCR产物:

PCR纯化产物43ul

10xBuffer 5ul

E1 1ul

E2 1ul 酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应2+h（Thermo 的Fastdigest系列快切酶，37℃反应30min-1h）。

PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物, 最后用30-50ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.

琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+1ul DNA Loading buffer混匀上样，150V 恒压电泳20-30min，保存电泳图片，确保回收到目的片段。

PCR产物酶切的简化步骤：

（1）取2-5ul PCR产物电泳验证是否有目的条带，若有，其余PCR产物直接进行酶切后切胶回收；若条带单一也可酶切后采用PCR产物纯化试剂盒回收。（2）直接将全部PCR产物电泳，目标片段切胶回收；回收的PCR产物直接酶切：17ul 产物+2ul 酶切10x buffer+0.5ul E1+0.5ul E2，37℃反应过夜或者37℃反应2+h （或Thermo快切酶1h），80℃ 5min灭活可直接用于连接。（确保酶切体系兼容后续连接反应体系）

二．载体制备

1. 质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。

2. 载体酶切（50ul）

质粒DNA 2-5ug

10xBuffer 5ul

E1 1ul

E2 1ul

ddH2O 补足至50ul

反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜（或Thermo 快切酶2h）。

3. 琼脂糖凝胶电泳及胶回收：取5ul酶切载体+1ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时等量未酶切的质粒做对照，保存电泳图片（切开后的线性载体应该是单一条带，比未酶切的环状载体跑得慢，后者通常可见线性、环状、超螺旋三条带）；切胶回收酶切载体，最后用30-50ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.

三、外源DNA片段插入质粒载体

1. 外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul体系）

DNA片段 6.5ul/7.0ul/7.5ul

载体2ul/1.5ul/1ul

T4 DNA Ligase（Thermo）0.5ul

Buf T4 DNA Ligase 1ul

反应条件：首选16℃过夜连接，其次22℃常温1h或者4℃连接24小时。

一般目的片段与载体摩尔比约为5-10:1，但是这里我们通常是按体积比。一定要做阴性对照：及上述体系连接酶以相同体积ddH2O代替。

2. 连接产物转化

将全部连接产物加入不少于10倍体积的感受态细菌（100ul分装的DH5a或TOP10）中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴静置2min，加入500-800ul（一般500）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温预培，40min-1h（若质粒为氨苄抗性无需预培养，时间允许不推荐）。8000 rmp离心45s，沉淀保留约100ul上清，吹打混匀后均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养14h以上。