分子克隆实验流程
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分子克隆实验流程
一、引物的稀释
1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；
2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；
3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）
二、目的基因的扩增
实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：
Reagent 25µL 50µL
10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µL
dNTP (10mM) 0.5µL 1µL
rT aq酶0.25μL0.5μL
primer (10μM) 1.25μL 2.5μL
Template DNA 2μL4μL
ddH2O 18.5µL 37µL
反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）
95℃预变性3min
（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x35
72℃后延伸7min
4℃保持
电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL
小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE
中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE
大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE
三、目的产物切胶回收（试剂盒）
四、连接
实验前准备：SolutionI在冰上融化
连接体系：
Reagent 10µL
胶回收DNA(50ng/μL)4µL
PDM-18T载体1µL
Solution I 5µL
反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜
五、转化
实验前准备：开启42℃水浴锅
实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）
1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；
2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；
3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
4、42℃热激90S（时间不能太长，也不能太短）后静置于冰浴3min，加入750μL无抗生素的LB液体培养基，37℃ 200rpm恒温震荡培养1h。
5、4000 rpm离心2min，弃上清同时保留50μL混匀菌体沉淀后均匀涂布于抗性平板上。
6、37℃恒温培养过夜。（16小时以上）
LB（amp）抗性平板的制备
配方：
胰蛋白胨3g 5g
酵母提取物 1.5g 2.5g
氯化钠3g 5g
琼脂 4.5g 7.5g
ddH2O 300mL 500mL
121℃高压灭菌20min，降温加入氨苄（amp）抗生素（amp：LB=1:1000）
六、摇菌
实验前准备：生物安全柜紫外照射30min
实验步骤：
1、取出过夜培养的LB固体培养基平皿，观察是否有菌落长出。
2、取3ml LB液体培养基于15ml管中，已经加入抗生素（氨苄），氨苄：LB培养基=1:1000（即：3μL amp+3ml LB）。
3、在15ml管上做好标记，分别加入从LB培养基上挑取的单个菌落，37℃250rpm恒温震荡培养过夜（8小时以上）。
七、菌液PCR（目的基因引物+载体引物）
实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
反应体系：
Reagent 20µL
10xbuffer (含Mg2+) 2µL
dNTP (10mM) 0.25µL
primer (10μM)0.5μL
Template DNA 2μL
rTaq酶0.25μL
ddH2O 15µL
反应程序：
95℃预变性3min，
（95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s）运行35个循环72℃后延伸7min，
4℃保持
九、测序PCR
实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、（BD+5xbuffer）Mix提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
反应体系：
Reagent 10µL
（BD+5xbuffer）Mix 2.1µL
模板DNA（纯化产物） 3.5µL
primer (10μM)0.75μL
ddH2O 3.65µL
反应程序：
96℃ 1min,
(96℃ 10s, 50℃10s, 60℃ 3min) x30
4℃ --
十、质粒提取、菌种保存、浓度测定: