分子克隆常用载体
常用的克隆载体
第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。
下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。
（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。
有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。
有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。
质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。
例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。
质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。
质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。
根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。
严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。
质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。
质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。
实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。
分子克隆
2
第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
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第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
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第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
第三章 分子克隆载体(Molecular cloning vectors)
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）［本章摘要］将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。
质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptⅡKS（±）。
λ噬菌体载体应用了λ噬菌体的生物学性质。
λ噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。
λ噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI 基因失活以及Spi 筛选等选择标记，分为插入型载体和置换型载体。
常见的插入型载体有：λgt10、λgt11及其衍生载体和λExcell 载体等。
常见的置换型载体有：EMBL3/4 及其类似载体，λgem-11 载体。
粘粒是带有cos 序列的质粒。
粘粒载体的工作使用了质粒和λ噬菌体的双重生物学性质。
常见的粘粒载体有：pJB8、pcos1EMBL 以及卡隆9 载体系列。
构建粘粒文库时会遇到许多困难，注意用对应的方法解决。
M13 噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载体可以制备单链DNA 。
常见的M13 噬菌体载体有M13mp18/19 ，其受体细胞有特殊的遗传标志。
带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌粒工作的时候需要M13K07 辅助噬菌体的帮助。
人工染色体是一种高通量的载体。
Y AC 是基于酵母染色体生物学性质构建的载体，BAC 是基于 F 质粒的生物学性质构建的载体，PAC 是基于P1 噬菌体构建的载体。
大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 和纤维素结合位点等。
2-2章 大肠杆菌分子克隆载体
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase） 不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’-末 端或5’-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子）， 显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。
λ噬菌体的基因组
5’3’
-3’ -5’
1.线状双链DNA分子，全长48.502kb。 2.两端的5’末端具有12碱基的突出互补的粘性末端 （cohensive end，cos），该末端称为cos位点。 可被λ编码的A蛋白所识别 3.当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端 连接成环状分子。
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
iii)
M13 噬菌体
单链DNA噬菌体的特点
（1）+DNA。（ssDNA） （2）复制型（RF）是双链环状DNA。
（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大 肠杆 菌。并产生噬菌斑。
（4）不存在包装限制。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 段的单链分子，便于作探针或测序。
第三章 分子克隆的载体 ppt课件
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
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•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
18
2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
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35
二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
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•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。
分子克隆载体
分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是分子生物学实验中常用的工具，用于在细胞中携带外源DNA序列，并实现其在细胞内的复制和表达。
根据其结构和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型。
本文将介绍常见的几种质粒载体及其特点。
一、表达质粒载体表达质粒载体是常用的质粒载体类型之一，用于外源基因的表达。
其中，pUC18是常用的表达质粒载体，其大小为2686bp，含有多个重要的功能元件。
例如，pUC18包含了抗生素耐受基因，如AmpR基因，使得细菌能够在含有抗生素的培养基上生长。
此外，pUC18还包含了启动子、终止子和复制起始位点等重要序列，能够实现外源基因在细菌中的高效表达。
二、克隆质粒载体克隆质粒载体是用于基因克隆的质粒载体类型。
pBluescript II KS+是常用的克隆质粒载体，其大小为2960bp。
pBluescript II KS+含有多个克隆位点，如多克隆位点（MCS），能够方便地进行DNA片段的插入和克隆。
此外，pBluescript II KS+还包含了T7和T3启动子，使得插入的DNA片段能够通过转录和转录后修饰的方式进行进一步研究。
三、RNA干扰质粒载体RNA干扰质粒载体是用于RNA干扰实验的质粒载体类型。
pSUPER是常用的RNA干扰质粒载体，其大小为3144bp。
pSUPER含有特定的siRNA序列，能够通过RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
此外，pSUPER还包含了启动子和选择性标记基因，使得转染细胞后能够通过选择性培养基筛选出抑制特定基因表达的细胞株。
四、双杂交质粒载体双杂交质粒载体是用于蛋白质相互作用研究的质粒载体类型。
pGBKT7和pGADT7是常用的双杂交质粒载体，分别用于检测靶蛋白的DNA结合活性和激活活性。
pGBKT7和pGADT7含有启动子、选择性标记基因和多克隆位点等重要元件，能够实现蛋白质相互作用的检测和分析。
五、表面显示质粒载体表面显示质粒载体是用于细胞表面展示外源蛋白的质粒载体类型。
基因工程第三章分子克隆载体
二、载体的报告基因(标记基因)
基因工程中利用载体上特意引入的一些具有特殊标志意 义的基因，用来证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目 的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。这 种具有标志意义的基因称为报告基因(report gene)，或标记 基因。
由于基因工程多用质粒作载体，质粒的报告基因在DNA 重组工作中具有重要意义，通过质粒的报告基因的表达可使 宿主细胞呈现一些可观察到的细胞生物学待征，通过质粒赋 予细胞的表型可识别和筛选重组体DNA的转化子细菌。
连接
切酶切割之后，发生双链断裂而形
成线性DNA(IDNA)，通称L构型(a) 。
质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借 居”
宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响， 宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。
①α-互补
是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整 的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互 补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实
现功能互补而建立的。
质粒
载体
N
②插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具
有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两 种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基 因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素 是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
3分子克隆载体
顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
常用克隆载体
PAC ( P1-derived artificial chromosome, 插入片 段可达300kb)
本图所表数字是 以 EcoR I 位点中央计为0， 从顺时针方向计算，至各 酶切位点的 第一个碱基的 数。在圆的内 部所表示的 各限制酶是在 pBR322 DNA上只有一个酶 切位 点的酶，圆外所表示的各 酶是在pBR322 DNA上 有2个至3个的酶切位点的 酶，（）内的数是酶切位 点数
质粒载体pUC19
缺点：插入M13的外源DNA超过1000bp时就不稳定，在 噬菌体增殖时会出现缺失。
噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列， 称为噬菌粒（phagemid）。
噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的 质粒。
pUC118/pUC119噬菌粒载体; pBluescript噬菌粒载体（最常用，M13载体在多克隆 位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子。）
常用的粘粒载体
用于在细菌中增殖真核DNA的粘粒载体 pJB8, c2RB, pcos1EMBL 用于转染哺乳动物细胞的粘粒载体 cos202/203，pWE15/16
粘粒的主要特征
（1）由质粒与组成的一种4-6kb的环状杂种DNA， 容易分离并可分离操作。既能像质粒一样在细菌 中繁殖，又能像一样在体外包装，并高效导入受 体细胞。
基因工程常用的克隆载体
克隆载体
目的基因进入细胞必须要有载体（vector） 的运载作用才能实现。
载体运载外源DNA至宿主细胞，是通过 载体自身DNA的核酸序列中插入了外源 DNA，再进入宿主细胞内进行的DNA复制， 在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得 了复制（扩增）和表达。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介二、分子克隆实验材料与设备三、分子克隆实验步骤1.设计引物2.合成目的基因3.构建表达载体4.转化受体细胞5.筛选转化子6.鉴定目的基因四、分子克隆实验注意事项五、实验结果分析与应用正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，通过复制特定DNA序列，将目的基因在受体细胞中稳定表达。
该技术在基因工程、生物科学等领域具有广泛应用，有助于研究基因功能、蛋白质表达及药物筛选等。
二、分子克隆实验材料与设备1.实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。
2.实验设备：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、分子克隆实验步骤1.设计引物根据目的基因序列，设计一对互补的引物。
引物应具备一定的特异性，避免非特异性扩增。
2.合成目的基因利用PCR技术，以DNA模板为基础，通过引物扩增目的基因。
反应条件需根据所使用DNA聚合酶的要求进行优化。
3.构建表达载体将目的基因与载体DNA连接，形成表达载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4.转化受体细胞将构建好的表达载体转化到受体细胞中，如大肠杆菌、酵母等。
转化方法有化学法、电转化法等。
5.筛选转化子转化后的受体细胞在含相应抗生素的培养基上生长，筛选出含有目的基因的转化子。
6.鉴定目的基因对筛选出的转化子进行进一步鉴定，如DNA测序、基因表达分析等。
四、分子克隆实验注意事项1.实验过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.选择合适的引物长度和退火温度，以提高扩增特异性。
3.转化受体细胞时，注意操作力度，避免细胞损伤。
4.筛选转化子时，严格控制抗生素浓度，避免过度筛选。
五、实验结果分析与应用1.分析PCR产物，判断目的基因是否成功克隆。
2.鉴定目的基因的表达水平，评估实验效果。
3.将成功克隆的目的基因应用于基因敲除、基因表达等研究。
通过以上步骤，您可以顺利完成分子克隆实验。
实验过程中需严格操作，确保实验结果的准确性。
分子克隆技术
Transformation
Culture in the medium containing antibiotic
E.Coli without vector die
E.Coli with vector grow
PCR
RT-PCR RTase
基因克隆需要一些工具酶。
Taq DNA Pol
Target DNA fragment
获取目的基因片段的几种方法：
（一）体外扩增法
1、DNA聚合酶链式反应（PCR）
2、逆转录-PCR（RT-PCR）NA的体外扩增 1、PCR
基本程序：
模板的变性 引物的退火 新链的延伸
如何利用PCR技术获得目的基因片段？
1、确定目的基因
G C T T A A A A T T C G
nick
Annealing
G A A T T C C T T A A G
nick
Sealed
T4 DNA ligase
Sealed
G A A T T C C T T A A G
T4 DNA连接酶连接单链切口：
应用T4 DNA连接酶时需注意的问题：
（1）低温操作。连接酶对温度非常敏感，很容 易失活。 （2）连接时，可根据厂家的建议选择最佳温度 和时间，一般16oC连接需要12-16小时。
CT……….. GA………. CC……….. GG………. GATCC…. G….
…..A …..TTCGA
…..G …..CTTAASticky endAGCTT…. A….
AATTC…. G….
有两种粘性末端：
1）5-端突出的粘性末端
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
分子克隆
用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速 生长的细胞，从而获得感受态细胞。 ②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。
（二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA 的吸收。 ④.然后将细胞接种于含相应抗生 素的培养基上，含有重组子的感受 态细菌将形成单菌落。 ⑤. 挑选单菌落进行相应的筛选及 鉴定分析。
合适的宿主细胞中才能进行复制、 扩增和表达。 宿主细胞分为两种：原核细胞和真 核细胞。
⑴感受态细胞(competent
cell): 系指利用理化的方法人工诱导 细菌，使之处于易于吸收和容纳外 源DNA分子的状态，这时的细胞就 称为感受态细胞。
⑵转化过程：
①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即
Ⅱ型限制性内切酶实际应用价值最大，这是 因为：
① Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰 活性；
② 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点， 切割精确；
③ 此类酶作用时只需要Mg2+参与。无需ATP。 因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪 切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物 学家的手术刀。
TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应
但是除阳性重组子以外．自身环 化的载体、未酶解完全的载体以及 非目的基因插入载体形成的重组子 均能转化细胞而能生长，故本法仅 是阳性重组子的初步筛选。
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落， 应小量培养后，再分离出重组质粒或重 组噬菌体 DNA ，用相应的内切酶 (1 种或 2 种 ) 切割重组子释放出插入片段，对于 可能存在双向插入的重组子还要内切酶 消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测 插入片段和载体的大小。
催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸
第六章 分子克隆常用的载体
共同特征： ①自主复制 ②易于扩增分离纯化 ③有非必需区 ④有单一酶切位点（多克隆位点）
单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点
多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶 切位点 ⑤有选择标记基因 ⑥有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）
质粒
本质是细菌染色体以外的遗传物质，是 一种简单的，环状DNA分子，能自主复 制。 命名：前一个小写p代表质粒，后两个大 写英文字母代表发现者或实验室，数字 代表编号，如pBR322质粒。
多功能质粒-PUC质粒
碱变性法抽提质粒DNA
该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。 其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB 长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双 链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链 DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链 便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅 是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链 的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠 绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺 旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离 心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
四、大肠杆菌质粒载体
1． pSC101质粒载体 2．pBR322质粒载体
– 分别由pMB1 (ori)、pSF2124(Ampr ) 和
Psc101(Tetr) 三种质粒通过载体改造后形成， 使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性 基因的理想的基因克隆载体。 Ampr （Scal、PvuI、PstI切点 ） Tetr （EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、 HindIII切点 ）
附加体型载体（YEP）
YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以 及酵母染色体的选择标记构成。2µm质粒含有 自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够 使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µ m质粒， 人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体 PYF92（如图6-21）就是由酵母的2µ m质粒、 pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成 的。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性， 一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载 体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是 基因克隆中的常用载体。
分子克隆常用载体
（3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小
制约的，因此不存在包装限制问题。
（4）可产生大量纯化的含外源片断的单链DNA分子 。
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2.M13载体筛选方法
插入→α-多肽→互补于受体细胞→半乳糖苷酶 无色噬菌斑←不分解X-gal(IPTG)
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20“尾巴”两部分组 成。
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2、Cosmid载体特点：
（1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部 必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子 代噬菌体颗粒）；
（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因 ）；
（限3）可具达有45高kb容左量右的）克；隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极 （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。
（1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入
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（2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之 间λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代
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13λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体 DNA大小只能： 36kb ~ 51kb。
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四、酵母细胞的克隆载体
♪1、整合型载体（YIP）
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YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA片段构成的。这类载体在细菌中复
制、扩增，进入酵母后可整合表达。
YIP型载体的特点是转化率低(只有1-
10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性 稳定，多用于遗传分析工作。
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2、复制型载体（YRP）