第二章 分子克隆载体与宿主

5）探针质粒 a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子， 终止子。 b) 装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗 性基因） c) 缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因


d) 当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，
报告基因才能表达。 e) 表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件 的强弱。


2.LacZ基因通常用于构建质粒载体的目的是什么？（） A. 编码一种限制性内切核酸酶，在转化细胞时用于切 割载体 B. 编码蓝色色素产物，可用于示踪转化的细胞 C.编码一种酶，将RNA转化为DNA D.编码一种抗生素抗性的酶 E.编码一种可检测的酶，当基因内部的位点插入任何外 源片段，ORF遭到破坏时，产物即不能表达。
5.遗传标记基因

标记基因的作用 标记基因的种类 常用的标记基因
标记基因的作用：

指示外源DNA分子（载体或重组分子） 是否进入宿主细胞 指示外源DNA分子是否插入载体分子形 成了重组子

标记基因的种类：

抗性标记基因 营养标记基因

生化标记基因
常用的遗传标记基因

四环素抗性基因（Tcr）

第一阶段（1977年前）：天然质粒和 重组质粒的利用 如pSC101, ColE1, pCR, pBR313 第二阶段：增大载体容量，建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因 第三阶段：进一步完善载体的功能以 满足基因工程克隆中的不同要求


4.载体的特点




至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物 体中有效复制，稳定遗传 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞 至少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA 插入 具有较小的分子量和较高的拷贝数 具有对受体细胞的可转移性, 提高载体导入受 体细胞的效率
复制子 (Replico) 结构。

2）可扩增性。
▲严紧型复制质粒 (Stringent)
每个细胞复制1-5 个质粒拷贝。 ▲松弛型复制质粒 ( Relaxed) 具有高拷贝数30-50个。

3) 可转移性在天然条件下，野生型质粒通过细菌
接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。
第二节 大肠杆菌克隆载体
主要内容

一. 质粒载体 二. λ载体 三. cos 质粒 四. 细菌人工染色体
质粒载体



1.质粒的基本特性 2.质粒的改造、构建与使用 3.质粒的分类及用途 4.常用的质粒载体
1. 质粒的基本特性
质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染 色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双 链DNA分子 (1~500 kb)
RNA 聚合酶识别起始.

c) 来自T7 噬菌体的T7 启动子。必须由T7 噬菌 体来源 T7 RNA聚合酶识别起始转录。 d) 表达载体用T7 启动子必须用能产生T7 RNA 聚

合酶的受体菌株 JM109 , DE3。
问题：



4.关于穿梭质粒载体，下面哪种说法最正确（） A. 在不同的宿主中具有不同的复制机制 B. 在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 C. 在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 D. 在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

4) 选择标记的插入失活
F plasmid


5） 不相容性
相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不
能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质
粒的不相容性。

a) 两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的
起始频率随机.

b) 分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分
裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。
问题


1.质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了（） 。 A.赋予宿主细胞某种可检测的特性 B.可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离 C.独立复制的能力 D.可复制自身DNA以及插入的外源DNA E.甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解 2.下列对质粒特性描述中，不正确的是（）。 A. 既能以单链环状又能以双链环状的形式存在 B. 是独立于细菌染色体DNA以外的复制子 C. 没有线性的质粒DNA D. 能够自身复制。
1.分子克隆载体的定义
分子克隆载体(vector)是一类可供外 源DNA插入并携带重组DNA分子进 入适当宿主细胞的DNA分子
2.分子克隆载体的功能:



为外源基因提供进入受体细胞的转移 能力 为外源基因提供在受体细胞的复制或 整合能力 为外源基因提供在受体细胞中的扩增 和表达能力
3.发展概况

Life cycle:
◇ lytic cycle(裂解周期） ◇ lysogenic cycle（溶源周期）
1. λ噬菌体的基本特点

3）. 噬菌斑 A. λ 噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基， 37C° 过夜。 B. 固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是 经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。同体培养基限
是在pBR322基础上衍生出来的一 系列质粒载体

pUC质粒载体的优点:
（2.7kb, 500~700 copies/cell）
◇具有更小的分子量和更高的拷贝数 ◇适用于组织化学法检测重组体，一步 实现对阳性克隆的鉴定 ◇具有多克隆位点区（MCS）
Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA
后即可测序。

3）整合质粒：
含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列， 克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞 后，准确重组整合在染色体的特定位置上。

4）穿梭质粒 a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构 及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属 的受体中复制并检测。 大肠杆菌---链酶素穿梭质粒，大肠杆菌---酵 母菌穿梭质粒。 b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载 体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复 制并遗传。
4. 常用的质粒载体

pBR322
Ampr
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Ampr Tcr
转化
Ampr
Tcs
外源DNA
Ampr Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Ampr Tcs
Amp+Tc平板
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp平板
重组DNA Ampr Tcs
灭活某些质粒的编码基因


质 粒 载 体 克 隆 的 一 般 步 骤
see movie
3．质粒的分类及用途

1）克隆质粒： 用于克隆和扩增外源基因。 2） 测序质粒：


a) 高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。
b) 含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近
区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性
二 . λ载体（ Lambda vector ）
主要内容：

1. λ噬菌体的基本特点 2. λDNA作载体的优缺点和解决办法 3. λ载体
1. λ噬菌体的基本特点


1）. 是大肠杆菌温和型噬菌体
2）.大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒，
噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，λ- 噬 菌体悬浮液加到大肠杆菌液体培养基，37C°培养6小时，培养 液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。

氯霉素抗性基因（Cmr） 抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖体 50 S亚基上，阻止蛋白质合成。 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使 氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不 能结合在核糖体上。

卡那霉素(Kanr)、 新霉素(Neor)、G418 抗性基因(G418r) 杀 菌 剂 ， Kanamycin ， Neomycin 和 G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗 生素，可结合在核糖体上，导致mRNA 发生错读。 来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基 因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能 进入细胞内。

荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生，可催化荧光 素氧化，并产生荧光 或 由 发 光 细 菌 （ Photobacterium fischeri）产生

绿色荧光蛋白基因（GFP）
GFP是由水母产生的一种可发光的蛋白质
问题



百度文库

1.一个质粒含有四环素抗性基因（tetr）和LacZ基因， tetr内有一Hind III位点，LacZ中有一EcoR I位点。如 用这两种限制性核酸内切酶切割载体一并连接入相应 的外源片段，则带有该重组质粒的细胞将（）。 A.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现蓝色 B.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现蓝色 C.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现白色 D.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现白色

pBR322质粒载体的优点:
◇具有较小的分子量
(经验表明,为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂,克 隆载体的分子大小最好不要超过10kb)
◇具有两种抗生素的遗传标记基因, 易于选择 重组DNA分子 ◇具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后， 每个细胞中可累积1000～3000个拷贝

pUC系列载体
第二章
分子克隆载体与宿主
Vecotrs and Host Cells
主要内容

第一节 分子克隆载体的特点 第二节 大肠杆菌克隆载体 第三节 真核细胞的克隆载体 第四节 宿主系统
第一节

分子克隆载体的特点


1.载体的定义 2.分子克隆载体的功能 3.发展概况 4.载体的特点 5.遗传标记基因

β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
◇ β—半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 ◇ 其氨基末端称为α链，羧基末端称为β链 ◇ α链负责将β链装配为四聚体 ◇ 单独的β链不具酶活性，只有在α链的帮助下组 装成β4才具有酶活性——α-互补作用 ◇ 为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)
抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖 体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制 核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合 成，细胞停止生长。 四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋 白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。

氨苄青霉素抗性基因（Apr） 杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞 膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰 细胞分裂，杀死细胞。 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细 胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解， 使氨苄青霉素失活。
2.质粒的改造、构建与使用

删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA的 装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细 胞) 加入遗传标记基因


在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆位点(multiple cloning sites， MCS) 根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列
(Covalently closed circular DNA, cccDNA)
Plasmids: smaller cycles of doublestrand DNA that do not carry essential genes

1). 具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和 控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立

制，透明圈外围大肠杆菌仍能生长.

4）. 一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个 噬菌体无性繁殖所产生的，是入- 噬菌体DNA 用于分子 克隆的基本原理。


6）表达质粒

a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转
录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点
（SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位
点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表
达。

b) 大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp 和来自
噬菌体强启动子 PL, PR 。它们由大肠杆菌
β—半乳糖苷酶基因的优点 ◇酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观
5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactoside
◇LacZα和β链基因的分别表达可使载体小 而容量的大
通常以 LacZα作为载体的遗传标记基因，而由 宿主细胞表达β链

葡萄糖苷酸酶基因（GUS） β-葡萄糖苷酸酶可将X-Gluc降解为 兰色产物 适用范围十分广泛，因为许多生物 中没有这种基因