液体菌种栽培蛹虫草的技术研究_李海洲

大 米 与 混 合 液 体 培 养 基 的 比 例 在 １∶ （１．２－１．３）之间，是 产 量 和 各 种 物 质 含 量 的 最 佳 比例。 ４．３ 湿 度
发 菌 阶 段 ，室 内 控 制 在 ６５％ 左 右 。 ４．４ 光 线
发菌阶段，光 线 黑 暗 菌 丝 发 育 较 快。 在 以 上 条件下，大米玉米培养基经过大约 １５ｄ白色菌丝 即可长满培养基，菌 丝 浓 密 茂 盛；蚕 蛹 经 ７－１０ｄ 感 菌 僵 化 ，在 培 养３－５ｄ，白 色 菌 丝 布 满 蚕 蛹 表 面 时进入转色催蕾阶段。
收 稿 日 期 ：２０１２－０７－１３
李 海 洲 等 ：液 体 菌 种 栽 培 蛹 虫 草 的 技 术 研 究
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胨 ２ｇ，磷 酸 二 氢 钾０．５ｇ，硫 酸 镁１ｇ、食 盐１ｇ，维 生素 Ｂ１３片，加入土豆煮 出 液，搅 拌 均 匀，纯 净 水 定容至１ ０００ ｍｌ，分 装 入 ５００ ｍｌ锥 形 瓶，每 瓶 约 ３００ｍｌ，加 入 ２－３ 滴 食 用 油 （防 止 通 气 培 养 时 产 生 泡 沫 ）。 脱 脂 棉 封 口 。１２１℃ 高 压 灭 菌３０ｍｉｎｓ， 冷 却 到 ３０℃ 以 下 备 用 。
（３）菌种 的 复 壮。 对 已 开 始 退 化 菌 种 进 行 复 壮，常用以下几种措施：① 改善营养条件。大多菌 种退化是由于营养条件的改变或缺乏而引起的， 一但营养条件得 到 改 善，就 可 以 恢 复 原 来 优 良 的 性状。实践中常 用 的 是 采 用 加 富 营 养 的 办 法，即 除 一 般 培 养 基 成 分 外 ，需 在 加 蛋 白 胨２－５ｇ，酵 母 膏０．５－２ｇ，牛 肉 膏 ２．５ｇ，维 生 素 Ｂ１ ０．０１－ ０．０５ｇ，必 要 时 可 加 入 适 量 的 复 合 Ｂ 族 维 生 素 和 微量蜂王浆。 待 菌 种 恢 复 良 好 性 状 后，再 移 植 到 普通培养基上。②经常分离纯化菌种。如果菌种 退化原因是屑纯 种 不 纯，即 已 退 化 的 菌 株 占 了 优 势 ，应 进 行 纯 种 重 新 分 离 。 生 产 上 使 用 的 菌 种 ，每 年要重新分离一 次，选 具 有 典 型 优 良 性 状 的 子 实 体进行组织 分 离、培 养。 也 可 每 年 进 行 一 次 孢 子 分 离 ，通 过 有 性 繁 殖 来 发 现 好 的 菌 株 ，再 用 组 织 分 离来巩固这些优良菌株的遗传性。
大 米 代 料 培 养 基 培 养 为 ：取 洗 净 的 广 口 瓶 ，每 瓶先装 ３０ｇ 大 米，１ｇ 蚕 蛹 粉，搅 拌 均 后，加 入 以 上液 体 混 合 培 养 基 ３５ ｍｌ，聚 乙 烯 薄 膜 封 口， １２１℃ 高压灭菌３０ｍｉｎｓ或１００℃灭菌８ｈ，冷却到
பைடு நூலகம்
３０℃ 以 下 备 用 。 在灭菌的接种 箱 内，按 无 菌 操 作 的 要 求 进 行
２ 液体菌种的制备
（１）所用仪 器：天 平、高 压 灭 菌 器、蒸 馏 水 器、 接 种 箱 、摇 床 、高 速 匀 浆 机 、恒 温 恒 湿 箱 、简 易 单 级 液 体 发 酵 装 置 、电 饭 锅 等
（２）液体菌种培 养 基 配 方：３００ｇ 去 皮 切 片 土 豆，加清水１ ０００ｍｌ煮沸；称取葡萄糖 ２０ｇ，蛋白
接种。在酒精灯 旁 操 作，打 开 培 养 瓶 的 封 口 膜 或 盖，用无菌注射器 吸 取 ５ ｍｌ液 体 菌 种，均 匀 注 入 培养瓶中，立 即 盖 好 封 口 膜 或 瓶 盖。 接 种 动 作 要 快，以 减 少 污 染，完 成 后，拿 到 经 灭 菌 的 培 养 箱 或 培养室进行培养。 ３．１．２ 玉 米 复 合 培 养 基 玉 米 （粉 碎 到 麦 粒 大 小）８９％，蛋白胨６％，酵母 粉 ２％，蔗 糖 ２．８％，铃 酸二 氢 钾 ０．１％，硫 酸 镁 ０．１％，料 水 比 １∶ （１．２－１．３）。 灭 菌 接 种 方 法 同 上 。 ３．１．３ 蚕 蛹 要 求 新 鲜 健 康 的 活 蚕 蛹 （干 蚕 蛹 产 品 未 经 昆 虫 活 体 转 化 ，品 质 较 差 ）用 清 水 清 洗 后 晾 干，７５％的 酒 精 擦 拭 表 面 消 毒，在 灭 菌 的 接 种 箱 内 ，用 无 菌 注 射 器 吸 取 液 体 菌 种 进 行 注 射 接 种 ，接 种结束置灭菌的栽培瓶中发菌。
（３）液体 菌 种 的 制 备 方 法。 ① 单 级 液 体 发 酵 装置吹氧法制备蛹虫草液体菌种。在灭菌的接种 箱 内 ，按 无 菌 操 作 的 要 求 ，在 接 种 箱 内 接 入 试 管 母 种，每瓶 接 入 ５ ｍｍ×５ ｍｍ 菌 种 ４ 块，连 接 好 单 级液体发酵 装 置。 接 种 后 放 在 ２２－２５℃ 的 条 件 下 静 止 培 养２ｄ，观 察 液 基 表 面 无 异 色 ，清 晰 ，即 可 通 氧 。 先 开 启 小 气 量 通 气 开 关 吹 氧３ｄ，再 开 启 大 气量通气开关吹 氧 ３－４ｄ。 培 养 过 程 中，每 天 检 查 ，观 察 液 基 是 否 出 现 浑 浊 ，出 现 浑 浊 说 明 可 能 被 污 染 ，应 废 弃 。 如 果 液 基 内 清 晰 ，有 小 菌 丝 片 段 出 现为正常。待菌丝 片 直 径 达 ０．３－１ ｍｍ 或 菌 丝 球充满液基，液 体 菌 种 制 作 完 成。 规 模 化 生 产 一 般采用多级液体菌种发酵罐。②摇瓶法制备蛹虫 草液体菌种。培养基配方同上，锥 形 瓶 加 入 ５－６ 粒小玻璃珠或洁 净 沙 石 （可 使 菌 球 分 布 更 均 匀）。 灭菌、冷 却、接 种。 置 ８０－１２０ｒ／ｍｉｎ 摇 床 上， ２２－２５℃的条件下震 荡 培 养 ５－７ｄ，待 菌 丝 片 直 径达０．３－１ｍｍ 或菌丝球充满液基，液体菌种制 作完成。③无菌水刮洗斜面菌种制备菌悬液。用 无菌水刮洗斜面菌 种，每 只 试 管 用 １０ｍｌ无 菌 水， 用无菌接种铲充 分 刮 洗 斜 面 上 的 菌 苔，收 集 刮 洗 水，置 灭 菌 的 高 速 匀 浆 机，１０ ０００ｒ／ｍｉｎ 匀 浆 １ ｍｉｎ，得菌悬 液。 ④ 无 菌 水 稀 疏 米 饭 培 养 基 上 的 菌种得到菌 悬 液。 试 管 母 种 接 种 大 米 培 养 基，培 育成蛹虫草原种，加入适量含 Ｔｗｅｅｎ－８０的无菌 水 ，清 洗 稀 疏 大 米 培 养 基 原 种 得 到 菌 悬 液 。
１ 菌种来源、分离纯化、复壮
１．１ 菌 种 来 源 （１）从科研院 所 或 具 有 资 质 的 生 产 单 位 直 接
引进高质量母种进行扩大培养。 （２）从野外适 宜 蚕 蛹 虫 草 生 长 的 环 境 或 人 工
栽 培 条 件 下 采 挖 、选 取 、分 离 纯 化 。 １．２ 菌 种 的 分 离 纯 化
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陕 西 农 业 科 学
２０１３（１）
液体菌种栽培蛹虫草的技术研究
李 海 洲１ ，张 京 国１ ，毛 海 霞２ （１．安康市蚕桑研究所 ，陕西 安康 ７２５０１９；２．安康市科技局，陕西 安康 ７２５０００）
摘 要：通过菌种的选取、分离纯化、定期复壮得到性状 稳 定 的 优 质 菌 种，采 用 单 级 液 体 发 酵 装 置、摇 瓶 法、无 菌水刮洗斜面菌种、稀疏大米培养基原种等方法制备 蛹 虫 草 液 体 菌 种 。以 大 米、玉 米 等 复 合 培 养 基 和 蚕 蛹 为 培 养 基 或 寄 主 ，采 用 液 体 菌 种 接 种 ，经 过 菌 丝 培 养 、转 色 催 蕾 、除 草 管 理 等 程 序 栽 培 蚕 蛹 虫 草 。 关 键 词 ：蛹 虫 草 ；液 体 菌 种 ；复 合 培 养 基 ；蚕 蛹
蛹虫草菌种的分离有组织分离法和孢子分离 法等。
（１）组 织 分 离 法 选 用 生 长 周 期 短，子 座 易 发 生 ，产 量 高 ，药 用 及 营 养 价 值 高 ，生 长 正 常 ，无 病 虫 害，没有散发孢子 的 健 壮 蛹 虫 草 作 为 培 养 母 种 的 出发菌株，在灭菌的接种 箱 内，用 ０．１％ 的 升 汞 溶 液或７５％的酒精对菌种进 行 表 面 消 毒，无 菌 水 清 洗 。 表 面 消 毒 处 理 后 ，用 单 面 刀 片 切 去 其 外 层 ，切 取 其内部组织约１ｍｍ３ 的小块，迅速移接到 ＰＤＡ 试管斜面培 养 基 中 央，塞 上 棉 塞，在 ２３－２５℃ 恒 温箱中培养 １０－１５ｄ 即 可 得 到 母 种。 得 到 的 母 种 在 经 过 分 离 纯 化 ，扩 大 培 养 即 得 到 栽 培 用 母 种 ．
５ 转色催蕾
菌 丝 体 成 熟 后 ，要 进 行 适 当 光 照 和 温 差 刺 激 。 每天应进 行 光 照 １２ｈ 左 右，光 照 强 度 １００－２００ Ｌｘ。夜晚 保 持 黑 暗。 白 天 温 度 ２１℃ 左 右，夜 晚 １６℃左右。经过３ｄ，菌 丝 体 开 始 转 色，７－１０ｄ， 菌丝体 逐 渐 变 成 橙 黄 色 或 黄 色。 转 色 后 再 培 养 １－３ｄ，园 丘 状 菌 丝 体 上 开 始 形 成 小 米 粒 状 物 ，原 基 形 成 。 蚕 蛹 在 菌 丝 培 养 阶 段 ，蛹 体 的 营 养 及 水
蛹 虫 草 为 子 囊 菌 亚 门，麦 角 菌 目，麦 角 菌 科， 虫 草 属 。 学 名 为 Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ，又 名 北 冬 虫 夏草、北蛹虫 草、虫 草 等。 蛹 虫 草 含 有 虫 草 素、虫 草 酸 、虫 草 多 糖 、蛋 白 质 、多 种 维 生 素 及 ２０ 多 种 矿 物质元素。蛹虫草在有效成分及功效上与天然冬 虫夏草相近。 二 者 可 相 互 代 替 入 药。 近 年 来，由 于因生态环境的 限 制 及 过 度 的 采 挖，天 然 冬 虫 夏 草 资 源 逐 渐 枯 竭 ，价 格 昂 贵 ，难 于 普 及 。 人 工 栽 培 蛹 虫 草 显 得 越 发 重 要 。 以 大 米 、玉 米 、蚕 蛹 等 为 培 养 基 或 寄 主 ，采 用 液 体 菌 种 栽 培 蚕 蛹 虫 草 ，具 有 栽 培成 功 率 高，生 产 周 期 短、原 料 易 购、产 品 质 量 好 等优点。具有良好的发展前景。